Florianópolis, junho de 2011

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DISCIPLINA: BIOQUÍMICA BÁSICA BQA5109 Replicação e Transcrição do DNA Florianópolis, junho de 2011

2. O Material Hereditário dos Cromossomos São Segmentos de DNA (genes) • Cada célula carrega em seu núcleo as instruções para a formação de um indivíduo completo... DNA NÚCLEO • Possui a informação que, em última análise, dita a função de uma proteína; • Características celulares são determinadas pelas proteínas que a célula produz; • Capacidade de autoduplicação. CROMOSSOMOS (DNA+PROTEÍNAS) CÉLULA ORGANISMO Quando uma célula se divide, cada célula leva uma cópia do DNA original

3. DNA Possui a Informação Para Codificar Proteínas e RNAs Cada célula carrega no seu DNA as instruções para a formação de um indivíduo completo Quando a célula se divide, as células filhas levam uma cópia dessa informação Origem a um novo ser com características semelhantes ao original... DNA confere a base molecular da hereditariedade!

4. Relembrando: O DNA Dupla-Hélice Estrutura Química Modelo Espacial Polímero de desoxirribonucleotídeos de 4 espécies dispostos em duas fitas de sentidos opostos (ANTIPARALELAS). A estrutura de dupla-fita é mantida por pontes fosfodiéster (que unem nucleotídeos numa mesma fita) e ligações do tipo ponte de hidrogênio que ligam as bases COMPLEMENTARES entre as fitas.

5. A Estrutura do DNA Fornece as Bases da Hereditariedade • A cópia do material hereditário é possível graças a natureza complementar das fitas do DNA (pareamento de bases)... Replicação: processo de biossíntese de DNA onde, a partir de uma molécula de DNA pré-existente formam-se duas moléculas filhas contendo uma das fitas da molécula mãe original. PROCESSO SEMICONSERVATIVO

6. A Replicação é Semi-Conservativa Características importantes • A replicação produz duas moléculas completas e idênticas a partir de uma molécula de DNA original Cada dupla-hélice filha é composta de uma fita velha (conservada) e uma fita nova (recém-sintetizada)

7. Em relação a Estrutura e ao processo de Replicação do DNA é CORRETO afirmar: • O DNA é uma molécula composta por polímeros de desoxirribonucleotídeos, dispostos em duas fitas, sendo ambas idênticas entre si. • Em relação ao pareamento de bases do DNA, bases púricas fazem ligação do tipo ponte de hidrogênio com outra base púrica na fita oposta na dupla-hélice. • Ligações do tipo fosfodiéster são responsáveis por manter as duas fitas do DNA unidas, auxiliando na estabilidade da molécula. • A replicação do DNA é dita semi-conservativa porque as duas novas moléculas de DNA idênticas, são sintetizadas a partir de uma molécula antiga. • A replicação do DNA é dita semi-conservativa porque cada fita na dupla-hélice do DNA novo possui uma fita nova (recém-sintetizada) e uma fita antiga (conservada).

8. Replicação – Ocorre Durante a Intérfase do Ciclo Celular

9. Replicação do DNA 1.Iniciação • A dupla-hélice do DNA é muito estável e proteínas auxiliam na separação das duas fitas... Não atuam em locais aleatórios 1- DNAa – Ligam-se a segmentos do DNA ricos em A=T e faz com que o DNA se dissolva, as fitas separam-se, formando regiões de DNA de fita simples; 2 – Proteína de Ligação do DNA de Fita Simples (SSB) – Mantém a separação das fitas e protegem o DNA de nucleases que clivam DNA de fita simples; 3- DNA-Helicase – Liga-se ao DNA de fita simples e a seguir move-se na região vizinha de dupla-fita, forçando as fitas a se separarem, desenrolando a dupla-hélice (requer ATP). Os locais onde o DNA é aberto são chamados de origens de replicação e são marcados por uma seqüência particular de nucleotídeos. GLAST (EAAT1) GLT-1 (EAAT2)

10. Replicação do DNA 1.Iniciação

11. Replicação do DNA 1.Iniciação • A síntese do DNA novo ocorre nas zonas ou forquilhas de replicação e é bidirecional...

12. Replicação do DNA 2. Alongamento da cadeia • DNA-Polimerase – Sintetiza a nova fita usando uma das fitas velhas como molde e catalisa a adição de nucleotídeos à fita de DNA em crescimento, verificando se foram corretamente incorporados. DNA-polimerase O pareamento de bases entre o desoxirribonucleotídeo que entra e os da fita-molde guia a formação de uma nova fita de DNA, complementar na seqüência de nucleotídeos à fita molde.

13. Replicação do DNA 2. Alongamento da cadeia DNA-polimerase catalisa a adição de nucleotídeos à extremidade 3`-OH de uma fita de DNA nova pela formação de uma ligação fosfodiéster com o grupo 5`-fosfato do nucleotídeo que está sendo incorporado Nova cadeia é sintetizada sempre na direção 5` 3` Os nucleotídeos entram na reação como nucleosídeos trifosfatados de alta energia e há quebra da ligação fosfoanidrido A DNA-polimerase permanece associada ao DNA e move-se ao longo da cadeia (3’ 5’) durante a polimerização

14. Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase Necessita de um Primer O mecanismo de polimerização do DNA apresenta dois problemas... 1. A DNA- polimerase precisa de um grupo 3'-OH para estender a cadeia de DNA Como se inicia a síntese de DNA? Ribonucleotídeos Solução: Uma enzima chamada primase sintetiza um PRIMER (10 nucleotídeos) de RNA Ao final do processo de replicação o primer é removido

15. Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase 2. A enzima DNA-polimerase só sintetiza fitas novas na direção 5` 3`, fazendo a leitura da fita molde na direção 3` 5`; Cada fita possui uma polaridade única (são antiparalelas) Ambas as novas fitas parecem crescer na mesma direção Como é possível sintetizar as fitas novas sobre um molde que está na direção oposta (5` 3`) ?

16. Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase Não existe síntese na direção 3' 5' !!! Solução: O problema é solucionado por uma manobra da enzima. A fita que deveria crescer no sentido 3' 5' é feita descontinuamente, em pequenos pedaços, com a DNA-polimerase trabalhando para trás a partir da forquilha de replicação. Os fragmentos são posteriormente unidos (DNA-ligase), formando uma fita contínua.

17. Replicação do DNA – Fita contínua (líder) e Fita Descontínua (atrasada)

18. Replicação do DNA 3. Terminação • Síntese de uma fita contínua a partir de fragmentos... O primer de RNA é alongado pela DNA- polimerase III até que outro RNA seja encontrado O primer de RNA é removido pela DNA-polimerase I (atividade 5`3` exonuclease) e a lacuna é preenchida com desoxirribonucleotídeos pela própria enzima (atividade 5`3` polimerase) A quebra restante é ligada pela DNA-ligase  catalisa a ligação fosfodiéster final entre os grupos 5’-fosfato da cadeia de DNA sintetizada pela DNA-polimerase III e o grupo 3’-OH da cadeia feita pela DNA-polimerase I.

19. Resumindo... Uma maquinaria de replicação, que envolve proteínas e enzimas, sintetiza o novo DNA A DNA-polimerase é a enzima responsável pela polimerização do novo DNA A polimerização sempre ocorre na direção 5`  3` Um primer de RNA é utilizado na síntese da nova fita (e posteriormente removido) A seqüência de nucleotídeos de uma nova fita do DNA é ditada pela fita molde As fitas novas são sintetizadas em direções opostas (contínua e descontínua) Fragmentos são unidos e duas fitas contínuas são formadas

20. Dogma Central da Biologia Molecular

21. Relembrando: O RNA Polímero de 4 tipos de ribonucleotídeos (4 tipos) unidos por ligação fosfodiéster, existente como fita simples RNAm RNAr RNAt

22. Características Essenciais da Transcrição • Altamente Seletiva: de acordo com o tipo celular, para algumas regiões do DNA muitos transcritos são feitos enquanto que, para outras, poucos transcritos são feitos. • RNA´s podem sofrer várias modificações: Adições terminais, desbastes, remoção de segmentos internos e junções. Estas modificações convertem o transcrito primário em uma molécula funcional.

23. Transcrição – Visão Geral • Transcrição: Processo de síntese do RNA, que utiliza uma das fitas do DNA com molde. 1 –Desenrolamento, abertura da dupla-hélice e exposição das bases de cada fita do DNA 2 -A seqüência de NT da fita do RNA é determinada pela seqüência de NT da fita molde do DNA. 3-Os ribonucleotídeos incorporados são covalentemente ligados à cadeia em formação do RNA em uma reação catalisada por enzima. A cadeia nova de RNA é produzida sempre na direção 5` 3`e os ribonucleotídeos são adicionados um por vez, de acordo com os nucleotídeos presentes na fita de DNA usada como molde. A enzima responsável pelo processo é a RNA-POLIMERASE

24. Transcrição – A RNA-Polimerase Enzima multimérica. Catalisam a formação de pontes fosfodiéster que unem os nucleotídeos. Percorre o DNA, estendendo a fita nova de RNA na direção 5` 3`. Utiliza nucleosídeos trifosfatos (NTP) que, através da ruptura de suas ligações fosfoanidrídicas, fornecem a energia que impulsiona a reação Funções na Transcrição: 1. Reconhece sítios de iniciação (sítios promotores) no DNA; 2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hélice do DNA próximo a ela, liberando um molde de fita única; 3. Seleciona o ribonucleosídeo fosfato correto e catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster; este processo é repetido muitas vezes à medida que a enzima se move ao longo do DNA; 4. Detecta sinais de terminação; 5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da transcrição.

25. Transcrição – A RNA-Polimerase • A RNA-polimerase... A RNA polimerase utiliza NTP como precursores e adiciona NMP à extremidade 3´ da ribose da cadeia de RNA em crescimento. Os nucleotídeos se unem através de uma ligação 3´-5´fosfodiéster, entre -OH de C3 da ribose de um nucleotídeo e -PO4- do nucleotídeo adjacente. A RNA-polimerase faz uma cópia de RNA a partir de um molde de DNA !!!

26. Transcrição – A RNA-polimerase

27. Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO • INICIAÇÃO: Envolve a ligação da RNA-polimerase a uma região do DNA que determina a transcrição de um gene em particular. Esta região é conhecida como REGIÃO PROMOTORA. Região Promotora I = Caixa de Pribnow = Sequência TATAAT –10. Situada 10 nucleotídeos à esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição. Região Promotora II = Sequência - 35 = Sequência TTGACA. Situada 35 nucleotídeos à esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição.

28. Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO • A região promotora não se localiza na fita molde... A enzima RNA-polimerase utiliza a fita 3’5’ do DNA como molde, produzindo uma fita de RNA na direção 5’3’. A fita molde do DNA é antiparalela e complementar à fita codificadora do DNA e ao RNA. O RNA sintetizado possui, portanto, a mesma direção que a fita codificadora e U no lugar de T. 5’- A T G C C A G T A G G C - 3’ (DNA) Fita codificadora 3’- T A C G G T C A T C C G - 5’ (DNA) Fita molde 5’- A U G C C A G U A G G C - 3’ RNA

29. Etapas na Síntese de RNA – 2. ALONGAMENTO • Alongamento: Uma vez que a região promotora tenha sido reconhecida, a RNA-polimerase começa a sintetizar o transcrito e a subunidade sigma é liberada; A RNA-polimerase desenrola a fita, expondo uma nova região de fita molde e adiciona ribonucleotídeos à nova fita de RNA, na direção 5` 3`. A nova seqüência de nucleotídeos é determinada pela fita molde do DNA

30. Etapas na Síntese de RNA – 3. TERMINAÇÃO • Terminação: O alongamento continua até um sinal de terminação ser atingido... No final, RNA-polimerase e o transcrito são liberados... OBS: Em alguns casos, uma proteína adicional (fator rô) pode ser requerida para a liberação do transcrito.

31. Transcrição em Eucariotos • Transcrição em Eucariotos: Mais complexa que em Procariotos e algumas etapas ainda não são bem compreendidas. • Além do reconhecimento de uma região promotora (CAAT e TATA Box), diversos fatores de transcrição complementares ligam-se a sítios no DNA, regulando o processo.

32. Modificação Pós-Transcricional do RNA = identidade do RNA • Após a formação do transcrito primário, os RNA´s são modificados e este transcrito inativo transforma-se em uma molécula funcional. RNA Ribossômico

33. Modificação Pós-Transcricional do RNA RNA Transportador Nucleotidil-transferase

34. Modificação Pós-Transcricional do RNA Geralmente idêntico ao transcrito primário em procariotos, mas é muito modificado nos eucariotos. RNA Mensageiro • Adição de CAP 5` e de uma Cauda poli-A: Facilita a iniciação da tradução e auxilia a estabilizar a molécula Poli-A-polimerase guanidil transferase Auxilia na estabilização do RNAm e facilita sua saída do núcleo. Guanina-7-metil-transferase

35. Modificação Pós-Transcricional do RNA RNA Mensageiro • Remoção de Íntrons: A funcionalidade do RNAm eucariótico pode envolver a remoção de seqüências de RNA (íntrons) que não codificam proteínas. As seqüências restantes (exons) são unidas para formar o RNA maduro. Catalisado por enzimas snRNPs (pequenas partículas de ribonucleoproteína nuclear) que são formadas por Proteína + RNA Permite que muitos genes possam ser processados, produzindo RNAm diferentes, dependendo do tipo da célula no qual o gene está sendo expresso ou o estágio de desenvolvimento 1 gene ≠proteínas

36. Resumo...