PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Cuantificación de Proteínas

1. PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Cuantificación de Proteínas

2. Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949 • El método de Biuret se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml. • Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína. • Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

3. Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 • El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, además de la reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino. • El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno. • El color azul, es determinado a 650 nm. • Este es un método muy sensible, por lo que permite trabajar con soluciones muy diluídas de proteínas (0.02 - 0.5 mg proteína/ml).

4. Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem.72, 248 • El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas. • El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad. • La reacción entre el colorante y la proteína es muy rápida (aproximadamente 2 min), y el completo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo. • Rango de detección: 0.5-10 mg proteína/ml.

5. Absorción Ultravioleta de las Proteínas • La mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina). • La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura. • Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm. • Una ecuación para calcular la concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es: (proteína)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm • La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de ácido nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0.1% (p/v) varía entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.

6. Absorción Ultravioleta de las Proteínas • Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico. • Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. proteínas. (proteína)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225) • La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).