Solujen pakastus (varastointi)

1. Solujen pakastus (varastointi) • Osa soluista varastoidaan tulevaa käyttöä varten • Rajallinen kasvupituus  täytyy säilöä • Soluterapiassa varastoidaan valmiiksi karakterisoitu linja (master cell bank), josta sulatellaan eriä hoitokäyttöön • Estetään muutoksia genotyypissä ja transformaatiota • Säilötään ennen senescenssiä, ”nuoria” soluja käyttöön • Estetään muutoksia solun toiminnassa • Pakastetaan nestetyppeen • -196oC • DMSO:ta, seerumia ja mediumia • DMSO = cryoprotectant  estää jään muodostumista solun sisälle • Sulatetaan ampullit nopeasti ja laitetaan kasvatusalustalle

2. Kontaminaatiot • Solujen hyvät kasvatusolosuhteet otollisia myös mikro-organismeille • Bakteerit • Hiivat • Sienet • Mykoplasma (pahin kontaminoija, koska vaikea havaita ja päästä eroon) • Voidaan välttää steriilillä työskentelyllä ja lisätyillä antibiooteilla • Soluterapiatuotteissa myös eläinperäiset materiaalit (xenogeneous) • Eläinperäinen seerumi (fetal calf/fetal bovine) • Feeder solut, esim hiiren endoteelisolut • Kasvutekijöiden tai vasta-aineiden valmistuksessa siirtyneet eläinperäiset proteiinit (Neu5Gc)  riski immunivasteen syntymiselle.

3. Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) • GXP järjestelmät • GMP = Good Manufacturing Practice • GLP = Good Laboratory Practice • Viitataan lääketuotannossa edellytettyihin formaalisiin laatujärjestelmiin, joiden soveltamisala ja sisältö on määritetty lainsäädännössä

4. Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) • Esimerkkejä GXP-järjestelmien edellyttämistä osa-alueista • Organisaatiokaavion ja vastuun määrittäminen • Tarkat toimintaohjeet työvaiheille • Laadunvalvontaan liittyvät testit ja analyysit • Materiaali, tuote, tuotantoympäristö • Toimintojen dokumetointi • Täydellinen jäljitettävyys • Toiminnot, lähtömateriaali, työntekijät jne.

5. Kantasolujen kasvatus erilaisiin soluterapiatarpeisiin • Alkion kantasolut • Sydäninfarkti • Sydänlihassolujen erilaistus ja karakterisointi • Aikuisen kantasolut • Mesenkymaaliset kantasolut • Luuvaurion korjaus • Osteoblastien erilaistus ja karakterisointi

6. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • Sydäninfarkti aiheuttaa yleensä laaja-alaisen sydänlihassolujen tuhon ja tilalle muodostuu sykkimätön arpikudos  sydämen toiminta heikkenee • Aikuisen sydänlihassolujen uusiutumiskyky on erittäin huono  kantasoluterapia • Alkion kantasoluista sydänlihassoluja  toiminta paranee • hMSCs ja immunomodulaatio  ei synny yhtä isoa arpikudosta  toiminta paranee

7. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • END-2 menetelmä: • END-2 solujen (visceral endodermal cells) maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle • Erilaistumattomien ihmisen alkionkantasolujen leikkaaminen END-2 solujen päälle. • EB (embryoid body)-menetelmä: • Erilaistumattomien hESC leikkaaminen suspensioon • 20 % FBS medium koko kasvatuksen ajan • EB:ien kasvatus 4-10 päivää suspensiossa  maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle.

8. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa Hiiren endodermaalisten solujen (END-2) maljaus gelatiini-päällystetylle pinnalle Erilaistumattomien alkion kantasolukolonioiden mekaaninen leikkaaminen Palat suspensioon jossa mukana 20% FBS  Embryoid Body Palat END-2 solujen päälle, ilman seerumia. Kasvatus 4-10 päivää suspensiossa Maljaus gelatiini-päälystetylle maljalle Kasvatus 9-20 päivää Sykkivien alueiden havainnointi Sykkivien alueiden havainnointi

9. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • Lääkeainekokeilut: - Ylärivillä perustaso - 0.017 mg/ml isoprenalin - 14.3 mg/ml esmolol - 25 mg/ml esmolol • Johtavuus: - sykintä alkaa elektrodista a - etenee b:n kautta c ja d d a c

10. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa: Yhteenveto • Erilaistumistehokkuudet yleisesti ottaen matalia • Suuri vaihtelevuus eri kertojen välillä • Karakterisoinnit • Sydänlihassolun kaltaisia • Troponin T sarkomeerirakenne • Cd-43, Nkx2.5, • Elektrofysiologiset ominaisuudet vastaavien fysiologisten sydänlihassolujen kanssa • Erilaistettuja soluja voitaisiin käyttää tulevaisuudessa esim. soluterapian kehittämsessä ja lääkeaine/toksikologia testauksissa • Varsinaisiin soluterapiahoitoihin riittävän solumäärän saavuttaminen vaikeaa • Lisäksi pitäisi saada puhdas sydänlihassoluviljelmä • Eroon erilaistumattomista hESCs  teratoma

11. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa • Mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat in vitro osteoblasteiksi • Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid • 2-5 viikkoa • Ilmenee morphologian muutoksina, ALP aktiivisuuden nousuna, kalsiumin mineralisaationa, kollageeni tyypin I expressiona ym. • Sovellutuksia suurten luuvaurioiden hoidoissa joko erilaistumattomina tai in vitro erilaistettuina yhdessä Scaffoldien ja kasvutekijöiden kanssa

12. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Potilaan luuydinnäyte Ficoll eristys  mononukleaariset solut Solujen maljaus muovialustalle Kasvatetaan solumäärää muutaman passagen verran Erilaistumattomat kantasolut Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid 3-5 vkoa Erilaistuneet osteoblastit - ALP aktiivisuus - mineralisaatio - tyypin 1 kollageeni

13. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa 3 viikon erilaistumisjakso  ALP aktiivisuuden määritys

14. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Genomisen DNA:n metylaatioasteen muuttuminen 3 viikon erilaistumisjakson jälkeen

15. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa • Mesenkymaalisten kantasolujen luuerilaistaminen in vitro on jo rutiininomaista • Pystytään tuottaan merkittäviä määriä osteoblasteja • Vrt. Sydänerilaistumisen tehokkuuteen • Erilaistettuja soluja käytetty kliinisissä kokeissa