La PCR

1. La PCR • Applications en santé animale (aperçu) • Voir l’ADN : l’électrophorèse • But de la PCR • Comment ça marche? • Comment procéder? • Quelques exemples Julie Lavoie, enseignante au Collège Lionel-Groulx

2. PCR : de nombreusesapplications en santé animale • Diagnostic de maladies infectieuses • Détection d’allèles récessifs chez des hétérozygotes • Génotypage d’animaux de laboratoire • Sexage animal • Tests de filiation

3. Voir l’ADN : l’électrophorèse • L’ADN : observation directe impossible • Y accrocher des molécules*qui s’illuminent aux UV • Grande quantité d’ADN… mais quel ADN?

4. *Des molécules qui s’accrochent à l’ADN et qui s’illuminent aux UV : • Le bromure d’éthydium (EtBr) • Le Vistra Green • Le SYBR Green Ces produits doivent être utilisés avec des précautionsextrêmes (on sait notamment que le bromure d’éthydium est un mutagène extrêmement puissant) Électrophorèse – animation : Pour accéder au site, cliquez ICIou lien sur page web EDC. Sur le site, choisir successivement : 1-Manipulation 2-Techniques 3-Sorting and sequencing 4-Gel electrophoresis : animation 2D

5. But de la technique PCR • Amplifier un segment d’ADN d’intérêt**afin de pouvoir le visualiser (en électrophorèse)

6. **Des segments d’ADN d’intérêt (1/3) : • Pour dépister un agent infectieux, amplifier un segment spécifique au génome du pathogène recherché, par ex.: • virus (ex.: ADN du Coronavirus entérique félin « PIF ») • bactéries (ex.: ADN de Chlamydia) • parasites (ex.: ADN du Ver du cœur canin) • Pour déceler un allèle récessif, amplifier un segment spécifique à l’allèle récessif causant la maladie, par ex.: • ex.: Syndrome du porc stressé « PSS » Suite…

7. **Des segments d’ADN d’intérêt (2/3) : • Pour tester le génotype d’un animal de laboratoire, amplifier un segments correspondant à la particularité génétique à contrôler pour cet animal, par ex.: • Un gène inactivé (knock-out) ou un gène ajouté dans un animal transgénique • Pour sexer un animal, amplifier des segments spécifiques aux chromosomes sexuels, donc : • Des gènes situés uniquement sur le chromosome X, sur le Y, sur le Z ou sur le W Suite…

8. **Des segments d’ADN d’intérêt (3/3) : • Pour établir la parenté (ex.: test de paternité) • ou l’identité d’un individu (ex.: domaine judiciaire), amplifier plusieurs segments d’ADN non codant • très polymorphes (hypervariables) entre individus, par exemple les microsatellites. • Pour chacun de ces segments, chaqueindividupossèdedeuxallèlesparmi des dizainespossibles. Le résultatd’ensembleestdonc unique pour chaqueindividu.

9. La PCR : comment ça marche? (1/3) • Imite « in vitro » la réplication de l’ADN***, mais seulement pour un segment d’ADN bien précis • On utilise une enzyme, la Taq polymérase, qui est une ADN polymérase thermorésistante ;(cette enzyme a étéisolée chez une bactérie vivant dans les sources thermales du Parc Yellowstone!) • PCR : polymerase chain reaction ou ACP : amplification en chaîne par la polymérase

10. ***La réplication de l’ADN « in vivo »(rappel) : • Les nucléotides « libres » s’unissent aux brins d’ADN «exposés», par complémentarité de leurs bases azotées : (A – T ) (C – G) • Le travail (ouverture de la double hélice, assemblage des nucléotides ajoutés et fermeture des deux doubles hélices) est effectué par une équipe d’enzymes dont l’ADN polymérase. • Réf. pour plus de détails : Lien/animation et Tortora et al. (2002) p. 137

11. La PCR : comment ça marche?(2/3) • L’ensemble des ingrédients est mis dans un microtube : • Extrait d’ADN • Amorces (« primers ») spécifiques à la région à amplifier • Taq polymérase et tampon de réaction • dNTP (nucléotides, portant les bases A, C, G et T) • H2O stérile • TOUT doit être fait pour éviter de contaminer les échantillons à analyser : stérilité du matériel et des solutions, travail en asepsie, etc.

12. La PCR : comment ça marche?(3/3) • Le microtube est mis dans un thermocycleur(machine à PCR) et subit une série de cycles au cours desquels la température varie. • Animation : • http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm Liens vers une autre animation sur la PCR : voir Médiagraphie ou page web EDC

13. La PCR : comment procéder? (1/2) 1°) Prélevement d’un échantillon contenant de l’ADN : • Recherche d’un pathogène dans un animal malade ou mort : prélèvement sanguin ou de viscères, car l’ADN du pathogène peut être détecté dans les tissus de l’animal (sang, foie, cerveau)… • Analyse des gènes de l’animal (pour déterminer son sexe, son espèce, ses allèles…) : prélèvement sanguin, cutané (buccal), de poils ou de plumes, ou même parfois ses fèces (excréments). *Important : Bien identifier l’échantillon et indiquer quel test est à effectuer, car les amorces diffèrent pour chaque test.

14. La PCR : comment procéder? (2/2) 2°) Extraction d’ADN à partir de l’échantillon Après cette étape, le microtube d’extrait contient tout l’ADN contenu dans l’échantillon : celui de l’animal tout comme celui des pathogènes présents dans les tissus prélevés. 3°) Amplification par PCR Après cette étape, le microtube à PCR contient des millions de copies du segment d’ADN recherché, celui auxquelles les amorces utilisées sont spécifiques. 4°) Visualisation des résultats par électrophorèse 5°) Interprétation du résultat

15. 1 2 3 4 5 6 7 Exemple : Sexage d’oiseaux • De gauche à droite : • Puits #1 = un standard, donc un mélange de fragments d’ADN de tailles connues, utilisés comme repères pour déterminer la taille des fragments obtenus par PCR • Les puits #2 et 3 = ADN de deux individus de sexe… • Les puits #4 à 7 = ADN de quatre individus de sexe…

16. Médiagraphie • Sources des images : • Thermocycleur : www.vignovin.com • Modèle moléculaire de l’ADN : http://www.futura-sciences.com/news-100-milliards-bases-banques-donnees-adn-arn_6997.php • Gel - sexage d’oiseaux : http://www.lavoliere.com/elevage/adn/adn_03.htm • Électrophorèse aux UV : http://www.mediscan.co.uk/cfm/resultssearch.cfm?box=DN&mediatype=image&log=nk • Réplication de l’ADN : http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Dna-split.png • Sites pertinents : • Informations sur différents tests PCR disponibles en santé animale : • Lien vers l’animation sur la PCR : http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm • Lien vers 3 images « fixes » tirées de l’animation précédente, avec courts textes : http://alexandre.alapetite.net/iup-gmi/cbgp/annexes.html#amplification • Lien vers une autre animation sur la PCR : http://www.dnai.org/index.htmune fois sur le site,choisir : Manipulation ; Techniques ; Amplifying Dans le même site est disponible également une animation sur le séquençage (dont la réaction est très semblable à celle de la PCR). Il est donc intéressant de comparer les deux dans ce même site. • Lien vers une animation sur la réplication de l’ADN « in vivo » et les enzymes impliquées : http://www.colvir.net/prof/chantal.proulx/animations/Replication-ADN.html