Candidato: Relatore interno: Chiara Marini Prof. Emanuele Cacci Relatore esterno:

1. Ruolo dei microRNA contenuti in esosomi derivati da cellulestaminali mesenchimali nel controllo delle funzioni microgliali Candidato: Relatore interno: Chiara Marini Prof. Emanuele Cacci Relatore esterno: Prof. Antonio Uccelli

2. Cosa sono le cellule staminali mesenchimali (MSC)? Perché usare le MSC a scopo terapeutico? Immunomodulazione MSC Neuroprotezione Uccelli et al., Nat Rev Immunol 2008 Induzione di oligodendrogenesi Adattata da Uccelli e Mancardi, Curr Opin Neurol 2010

3. Possibili meccanismi di interazione tra MSC e le cellule dell’immunità innata e adattativa in vitro ? MSC Adattata da Uccelli et al., Nat Rev Immunol 2008

4. La microglia mostra un cambiamento fenotipico e funzionale in risposta agli stimoli ambientali che riceve Perry et al., Nat Rev Neurol 2010

5. MHC I MHC I MHC II TLR Nurr-1 TREM-2 CX3CR1 Adattata da Pacheco et al., Biochem Genet and Mol Biol 2012 CX3CL1 CX3CL1 MSC Adattata da Giunti et al, Stem Cells 2012

6. I microRNA (miRNA) presenti negli esosomi modulano l’espressione genica Pre-miRNA Lai, Regen. Med. 2011 Vella e Slack, Worm book 2005 Lo scopo del lavoro è verificare in vitro che le MSC esercitino i loro effetti paracrini sulla microglia, almeno in parte, attraverso il rilascio di specifici miRNA contenuti nei loro esosomi.

7. Identificazione di miRNA up-regolati nelle MSC modulatorie

8. I miRNA up-regolati nelle MSC stimolate con IFNγ sono coinvolti nell’espressione di molecole associate al profilo modulatorio delle MSC SLP-I 1.5 * * 1.0 * * fold induction * 0.5 0.0 g MSC +inh1 +inh2 +inh3 +inh4 MSC+IFN g g g g MSC+IFN MSC+IFN MSC+IFN MSC+IFN *p<0,05 **p<0,01 IL-18bp 2.0 * 1.5 ** ** 1.0 ** * fold induction 0.5 0.0 g MSC +inh1 +inh2 +inh3 +inh4 MSC+IFN g g g g MSC+IFN MSC+IFN MSC+IFN MSC+IFN Inh1 = antagomir del miRNA 466i 3p Inh2 = antagomir del miRNA 466m 5p Inh3 = antagomir del miRNA 466q Inh4 = antagomir del miRNA 669c 3p

9. I miRNA up-regolati nelle MSC immunomodulanti influenzano il fenotipo molecolare della microglia attivata? Per rispondere a questa domanda abbiamo transfettato la linea cellulare immortalizzata microgliale (N9) trattata con LPS con sequenze analoghe ai miRNA (mimics) e analizzato la variazione di espressione di geni pro-infiammatori e anti-infiammatori

10. Le N9 attivate con LPS non over-esprimono i miRNA up-regolati nelle MSC immunomodulatorie *p<0,05 *

11. La transfezione con mimics di miRNA specifici induce cambiamenti nel fenotipo molecolare della microglia attivata con LPS IL-1β TNF-α 30 4 3 20 * fold induction fold induction 2 ** ** ** 10 1 * ** ** ** ** 0 0 *p<0,05 **p<0,01 miRNA 466q miRNA 467f miRNA 466q miRNA 467f miRNA 466m5p miRNA 3082 5p miRNA 466m5p miRNA 5126

12. MSC +IFN-γ per 24 ore Lasciate MSC in terreno senza siero per 24 ore +ATP per 20 min prelevato il secretoma + Total Exosome Isolation reagent (Invitrogen) per 24 ore a 4°C cfg 10.000 g per 1 ora a 4°C Exos -MSC+γ Exos -MSC+γ +ATP ALIX pellet esosomi

13. Non tutti i 9 miRNA identificati sono espressi nello stesso modo dalle MSC modulatorie e dagli esosomi derivati MSC esosomi MSC esosomi MSC esosomi 1.5 4 1.5 1.5 2.0 80 3 60 1.5 1.0 1.0 1.0 fold induction fold induction fold induction fold induction fold induction fold induction 2 40 1.0 0.5 0.5 0.5 1 20 0.5 0.0 0 0 0.0 0.0 0.0 esosomi MSC MSC esosomi MSC esosomi 4 1.0 3 1.5 1.5 4 3 0.8 3 fold induction 2 1.0 1.0 2 0.6 fold induction fold induction fold induction fold induction fold induction 2 0.4 1 1 0.5 0.5 1 0.2 0 0.0 0 0.0 0.0 0 esosomi MSC esosomi MSC esosomi 1.5 2.0 1.5 MSC 3 1.5 2.5 1.5 1.0 1.0 2 2.0 1.0 fold induction fold induction fold induction fold induction 1.0 fold induction 1.5 fold induction 0.5 0.5 1 0.5 0.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.0 0 0.0 0.0 miRNA 5126 miRNA 466q miRNA 466m 5p *p<0,05 * * * * * miRNA 466i 3p miRNA 3082 5p miRNA 467f * * * miRNA 466i5 p miRNA 467g miRNA 669c 3p * * * * *

14. Conclusioni Le MSC modulatorie (stimolate con IFNγ) mostrano una up-regolazione significativa di 9 specifici miRNA Alcuni specifici miRNA, up-regolati nelle MSC immunomodulanti, influenzano l’espressione di geni associati con lo stato attivato della microglia, inducendo la down-regolazione dell’espressione di geni M1-like o up-regolando l’espressione di CX3CR1, marcatore tipico del fenotipo M2-like Gli esosomi ottenuti dalle MSC stimolate con IFNγ mostrano una modulazione dell’espressione di miRNA rispetto alle cellule parentali I risultati di questo lavoro suggeriscono che specifici miRNA, contenuti negli esosomi derivati da MSC modulatorie, potrebbero modificare il fenotipo microgliale e mediare, almeno in parte, gli effetti paracrini delle MSC

15. Le MSC in vivo rallentano il progredire della sclerosi laterale amiotrofica (SLA) influenzando l’attivazione microgliale

16. Progetto di ricerca con l’obiettivo di analizzare l’effetto dei miRNA sul fenotipo molecolare e funzionale della microglia primaria isolata da cervelli di topi SOD1-G93A, modello animale della SLA.

17. Attivazione della glia durante il progredire della SLA Boillee et al., Neuron 2006

18. IL-1β TNF-α 1.5 2.0 ** 1.5 1.0 fold induction fold induction 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 mSOD wtSOD mSOD wtSOD Caratterizzazione del fenotipo della microglia di mSOD1 in ex-vivo alla fase finale della patologia (135°) *p<0,05 **p<0,01

19. In futuro • Confermare l’effetto immunomodulatorio delle MSC sulla microglia primaria • Monitorare e confermare il trasferimento del contenuto degli esosomi dalle MSC alle cellule della microglia. • Predire e validare gli mRNA target dei miRNA rilevanti.

20. Ringraziamenti Prof. Emanuele Cacci Prof. Antonio Uccelli Dott.ssa Debora Giunti Dott.ssa Benedetta Parodi Dott.ssa Nicole Kerlero de Rosbo Grazie per l’attenzione!!!