“Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias”

1. Universidade Federal de Santa Catarina • Departamento em Bioquímica • Programa de Pós-Graduação em Bioquímica • Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação “Como a Bioquímica auxilia na descoberta de novas terapias” Centro de Biologia Molecular Estrutural Palestrantes: • Gabrielle do Amaral e Silva Muller: “Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos” • Priscila Graziela Alves Martins: “Inibição enzimática como novo alvo para o tratamento de doenças como tuberculose, diabetes e peste” • Tiago Bortolotto: “Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) podem ser usados em terapias?”

2. Centro de Biologia Molecular Estrutural Como a proteômica pode auxiliar a identificar novos alvos terapêuticos Universidade Federal de Santa Catarina Departamento em Bioquímica Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Projeto REUNI: Integração de alunos de Graduação – Pós-graduação Gabrielle do Amaral e Silva Muller 201007739 Florianópolis, 02 de junho de 2011

3. DNA Pré- RNAm RNAm Proteoma Proteoma • A palavra PROTEOMA refere-se as PROTEínas expressas por um genOMA. • Conceitualmente a proteômica engloba o somatório de todo o produto gênico, isto é, todas as proteínas em uma célula ou organismo vivo. • Técnica que visa caracterizar processos biológicos e permitem a descrição de mecanismos celulares.

4. Por que utilizar a proteômica Moléculas biomarcadoras são utilizadas como uma importante ferramenta para detecção e monitoramento e tratamento de doenças. O status patológico de um indivíduo pode ser verificado por : Genes alvos: presente em células sadias e patogênicas. Alterações na transcrição: RNA muitas vezes é expresso, porém não é traduzido. Proteínas: refletem diretamente se o individuo está com determinada doença por meio da interação ptn-anticorpo –ELISA. Na busca de novos alvos terapêuticos vem sido utilizada a proteômica, pois ela revela proteínas biomarcadoraspermitindo a identificação de indivíduos doentes X indivíduos saudáveis.

5. Proteômica • Em 2004, haviam 1619 artigos somente com pesquisas na área da proteômica (hoje - 29564); • Destes 192 artigos eram referente a proteômica clínica (hoje -3702); • E, 71 eram referentes a procura de moléculas biomarcadoras utilizando-se a proteômica como ferramenta (hoje - 5247);

6. Câncer • Diagnóstico: Próstata, mama, pâncreas, fígado, câncer de cabeça e nuca; • Proteínas sinalizadoras são pouco abundantes em estágios iniciais; • Falso negativo: indivíduos com câncer o exame negativo; • Falso positivo: indivíduos sem câncer e exame positivo; Proteína CA – 125 (Câncer ovariano): são positivos 50 % a 60%. É elevado endometriose e gravidez;

7. NationalCancerInstitute • 2006: ClinicalProteomic Technologies for Cancer (CPTC) foi fundada para acelerar o desenvolvimento de tecnologias mais sofisticadas na busca de biomarcadores.

8. Proteômica

12. Vantagens proteômica • Técnica relativamente barata; • Rápida; • Poderosa ferramenta na busca por biomarcadores em fuidos e tecidos humanos; • Géis 2DE com espectrometria de massa e a utilização de sofisticadas ferramentas de bioinfomática são capazes de discriminar estados iniciais da doenças, de tumores belignos e malignos.

13. Desvantagens proteômica • Grande quantidade de proteína; • Não detecta proteínas pouco abundantes; • Durante a detecção pode ir outros tecidos e isso pode resultar na diminuição da precisão do método; • Antes de iniciar a busca por biomarcadores é necessário a padronização e reprodutibilidade dos géis; • Comprovação em diversos laboratórios;

14. Proteômica • Proteômica sistemática: mapa protéico de: • Tecidos • Células • Compartimentos celulares • Proteômica diferencial:faz análise das modificações a nível protéico comparativamente com proteínas de referência: • Desenvolvimento • Interações entre microorganismos e hospedeiros • Tratamentos

15. Fluxograma das etapas experimentais

16. Extração da amostra Não existe um método Universal; Objetivo a serem visualizados no gel 2DE: Maior quantidade de proteína possível ou somente um subgrupo de proteínas; Tampão de lise Lise mecânica da célula Gelo por 20 min 30´ a 1200 x g Diversas macromoléculas Proteínas Solubilização das ptns Métodos de ruptura celular

17. Métodos de quantificações de proteínas 2D Quant Kit Com base na concentração da curva padrão da BSA. Proteínas oriundas da extração 480 nm Bradford Com base na concentração da curva padrão da BSA. 545 nm

18. Limpeza das amostras • Fosfolipídios e ácido nucléicos: listras horizontais; • Sal provoca alta condutividade na fita de pH: pode provocar desidratação em algumas porções do gel e hidratação em outras. • Ácidos nucléicos: causam aumento da viscosidade da amostra, aparecimento de bandas adicionais, obstrui poros e liga-se a proteínas. • Polissacarídeos: bloqueiam poros do gel, aumenta o tempo de focalização; • Lipídeos: ligam-se a proteínas e diminuem a mobilização das mesmas no gel.

19. Solubilização das proteínas Agentes Caotrópicos: Uréia e Tiouréia Agentes Surfactantes: CHAPS Agentes redutores: DTT

20. Re-Hidratação da amostra em gradiente de pH • Temperatura ambiente 25oC; • Over night; Tiras de stripcom pH imobilizado Tampões-acrilamida

21. Separação das proteínas em 1ª Dimensão • É um método eletroforético que separa as proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos; • Primeiro passo: escolha a faixa de pH ideal para a sua amostra; • Temperatura; • 3500V a qual é mantida por até mils volts/hora; Corrente elétrica

22. Separação das proteínas em 1ª Dimensão Strips foram removidos Cerâmica IEF Strips foram posicionados Paper Pads umedecidos Ajuste dos eletrodos Total: 15500 V/h e 25 uA/strip Ettan IPGphor 3

23. Eletroforese em 2º Dimensão É um método eletroforético que separa componentes de uma amostra de acordo com o peso molecular. Esta técnica é realizada em gel de poliacrilamida contendo SDS. Separação 1ª dimensão Separação 2º dimensão 12,5% Após coloraçãocom CoomassieBlue G-250 por 24h Preparação do gel em placas: Homogêneo; Concentração da acrilamida é graduada.

24. Análise das imagens dos géis • Análise simultânea de diversas proteínas • Permite comparar todas as proteínas expressas por uma célula em condições diferentes.

25. Análise das imagens no gel Volume dos spots: permitindo uma quantificação relativa Presença ou Ausência de spots Posição dos spots (Ex. modificações pós-traducionais)

26. Digestão in-gel Série de passos Excisão dos spots Descoloração Desidratação tripsinização Extração dos peptídeos

27. Identificação das proteínas por espectrometria de massa • Espectrometria de massa é uma técnica que permite determinar a massa molecular de proteínas/peptídeos e a seqüência de aminoácidos. • Esta informação é utilizada para identificar a proteína comparando bases de dados de seqüência de nucleotídeos e de proteínas. • Também é utilizada para determinar o tipo e localização das modificações pós-traducionais das proteínas. Sistema à vácuo Fonte de ionização Analisador de massa Amostras 2-DE Detector

28. Identificação das proteínas por espectrometria de massa

29. Obrigada!!