530 likes | 1.05k Views
KROMATOGRAFI. Adalah suatu teknik pemisahan atas dasar perbedaan sifat fisik dan kimiawi dari zat penyusun suatu campuran Adanya tendensi molekul suatu zat untuk : - larut dalam suatu cairan - teradsorpsi pd butir zat padat yg halus dg permukaan yg luas
E N D
Adalah suatu teknik pemisahan atas dasar perbedaan sifat fisik dan kimiawi dari zat penyusun suatu campuran • Adanya tendensi molekul suatu zat untuk : - larut dalam suatu cairan - teradsorpsi pd butir zat padat yg halus dg permukaan yg luas - masuk ke fase uap atau menguap
JENIS KROMATOGRAFI • Kromatografi Lapis Tipis • Kromatografi kolom : • Kromatografi adsorbsi • Kromatografi partisi cair-cair • Kromatografi pertukaran ion • Kromatografi filtrasi gel • Kromatografi Gas Cairan
POLARITAS • Adanya pemisahan kutub muatan positif dan negatif dr suatu molekul sbg akibat terbentuknya konfigurasi tertentu dr atom-atom penyusunnya. • Dg dmkn molekul tsb dpt tertarik oleh molekul yg lain yg jg mempunyai polaritas. • Tingkat pemisahan dr muatan tsb menentukan derajat polaritasnya, dmkn jg daya tariknya.
Sifat polaritas, khususnya digunakan sbg petunjuk sifat zat pelarut, adsorben dan senyawa-senyawa yg dipisahkan (solute). • Air termasuk zat pelarut & mempunyai polaritas terbsr krn konfigurasi elektron dan geometri molekulnya dpt menghasilkan dipol permanen yang sangat kuat.
ADSORBEN & PELARUT • Dpt bersifat polar atau non polar • Adsorben polar = silika & alumina, dpt mengadsorp solut yg bersifat polar. • Adsorben non polar = arang (charcoal)
ADSORBSI & PARTISI • Keduanya dipengaruhi oleh perbedaan polaritas solute yang dipisahkan Polaritas mrpkn faktor yg menentukan daya larut dan terjadinya adsorbsi solute
ADSORBEN • Silika gel • bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat asam • digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT). • Alumina • bersifat basa dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. • digunakan untuk kromatografi kolom
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ( K L T )
Mrpkn kromatografi adsorbsi dan adsorben bertindak sbg fase stasioner. • Dapat digunakan untuk memisahkan : • ion-ion organik • komplek senyawa organik dg anorganik • senyawa organik alami dan sintetis • Pemisahan lebih sempurna, kepekaan tinggi dan dpt dilakukan dg cepat
ADSORBEN • Silika gel ( asam silikat ) • Alumina ( aluminum oxyde ) • Kieselguhr (diatomeous earth) • Selulosa
SILIKA GEL • Silika Gel G • mengandung 13% Kalsium Sulfat sebagai zat perekat • biasanya mengandung ion logam (besi) dihilangkan dg pelarut metanol : asam HCl pekat = 9 : 1 • Silika Gel H • digunakan untuk pemisahan yang spesifik, terutama lipida netral. • dpt memisahkan berbagai digliserida spt 1,2 digliserida dari 1,3 digliserida; fosfatidil gliserol dari poligliserida fosfat. • Silika Gel PF • senyawa organik yg terikat dpt berfluoresensi.
ALUMINA • Mampu memisahkan bermacam senyawa terpen, alkaloid, steroid,alisiklik, alifatik dan aromatik • Tidak mengandung zat perekat • Sifat sedikit alkalis • Dapat digunakan dengan ataupun tanpa aktivasi
KIESELGUHR • untuk pemisahan senyawa polar.
PEMBUATAN PLAT • Untuk KLT Mikro • Mis. Silika gel G = 35 gram adsorben dilarutkan dalam 100 ml zat pelarut kloroform-metanol (2:1 v/v). • Plat kaca dicelupkan dalam larutan tsb. • Diuapkan selama 5-10 mnt u/ mencegah retak pd lapisan adsorben atau terjadinya case hardening. • Untuk KLT Makro • Suspensi adsorben silika gel H dicampur dg air = 30 g / 60-70 ml air • Plat berukuran 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, dan 20 x 20 cm. • Keuntungannya : adsorben dapat melekat lebih baik, dpt dibuat lebih tebal u/ kepentingan tertentu, dapat dilaksanakan pada tempat yg lebih luas • Kerugiannya : pembuatan lebih sukar & perlu aktivasi plat dg pemanasan 110oC selama 1 jam.
Cara pembuatan plat yg besar : • plat kaca dicuci dg detergen, dibilas dg aquades & dikeringkan. • Suspensi adsorben yg telah dibuat dilapiskan pd permukaan plat kaca menggunakan aplikator (Stahl Desaga). • Tebal lapisan antara 250 mm – 2mm • Plat yg sudah terlapis sebelum di aktifkan harus didiamkan dulu pada suhu kamar selama + 30 menit.
MENETESKAN SAMPEL • Gunakan luas plat sesuai kebutuhan • Buat garis dg jarak 8 – 10 mm (u/ plat mikro) dan 1,5 – 2,0 cm (u/ plat makro) dar dasar plat. • Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap (ttk didihnya 50 – 100oC) • Larutan sampel diteteskan pada plat menggunakan pipet mikro atau syringe dan dibiarkan mengering sebelum tetesan berikutnya dikerjakan. • Jumlah sampel yang diteteskan dpt berkisar antara 5-100mg dari larutan 0,1 % • Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2 untuk mencegah terjadinya kerusakan sampel karena oksidasi.
PENGEMBANGAN • Menggunakan wadah tertutup yg berisi senyawa pelarut. • Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi sampel dalam sistem pelarut. • Pemilihan sistem pelarut atas dasar like dissolves like, misalnya untuk memisahkan lipida digunakan sistem pelarut heksan : eter : asam asetat = 80 : 20 : 1 • Pengembangan di akhiri bila ujung zat pelarut pada plat telah mencapai + ¾ tinggi adsorben (15 – 16 cm) • Pengeringan plat dg aliran gas N2
METODE PENGEMBANGAN • Pengembangan satu dimensi • Berjalan 1 arah dg 1 macam sistem pelarut • Pengembangan dua dimensi • Dikerjakan 2 arah • Sampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2 cm dari kanan & bawah) untuk plat 20 x 20 cm • Setelah pengembangan I selesai, plat dikeringkan dg gas N2 • Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg menggunakan sistem pelarut yang ke II dg memeutar plat 90o.
Pengembangan ganda • Dikerjakan searah (1 dimensi) dan dilaksanakan beberapa tahap (umumnya 2 tahap) • Sistem pelarut yg digunakan berbeda • Masing-masing tahap pengembangan di akhiri dg pengeringan sblm dilakukan pengembangan berikutnya. • Mis. Pemisahan lipida netral dan lipida polar . Pengembang I = kloroform : metanol : aquades = 60 : 25 : 4, dihentikan setelah permukaan pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan, dikembangkan lagi dg sistem pelarut Heksan : Eter = 4 : 1.
VISUALISASI DAN IDENTIFIKASI • Untuk melihat komponen penyusun yg sudah terpisah setelah proses pengembangan • Bersifat destruktif dan non destruktif • destruktif akan merusak sampel secara irreversible (u/ pengukuran kuanti & kualitatif) • nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran kuantitatif • Bersifat umum dan spesifik • Identifikasi • membandingkan posisi spot dg senyawa standar • visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg mengandung gugus amino akan menunjukkan spot kuning jingga)
Uap iodium • Spot akan berwarna coklat dg dasar putih • Tidak merusak komponen yg telah terpisah • Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg tidak jenuh (dg ikatan rangkap) • Sinar UV • memberikan fluoresensi pd plat yg mengandung unsur fosfor • sifatnya non destruktif • Charring • penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn dipanaskan pd suhu 125oC • Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon yang berwarna hitam
Reagensia umum(terbatas u/ senyawa organik yg non volatil) • H2SO4 pekat • senyawa organik akan mjd spot hitam • H2SO4 - Na2Cr2O7 • senyawa organik akan mjd spot hitam • H2SO4 - K2Cr2O7 • senyawa organik akan mjd spot hitam • H2SO4 – HNO3 • senyawa organik akan mjd spot hitam • HClO4 • senyawa organik akan mjd spot hitam • Iodium • senyawa organik akan mjd spot coklat
Reagen Spesifik • Untuk mendeteksi secara kualitatif & mengenal adanya gugus tertentu dalam senyawa yg dipisahkan. • Reagensia ini bersifat destruktif
Anilin pthalat • Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan memberikan berbagai warna • Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc • Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat. • Karbohidrat menunjukkan warna biru • Antimon triklorida dalam CHCl3 • Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid, steroid glikosida,lipida alifatik,dan vit A. • Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna tertentu • Bromokresol jambon • Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam dikarboksilat • Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau jingga
Bromokresol hijau • Pengenal asam karboksilat • Senyawa tersebut akan memberikan warna kuning/jingga • 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH) • Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk warna kuning sampai kemerahan. • Reagensia Dragendorf • Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik (mberikan warna orange) • Feri Klorida • Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.
Fluorescein-Br2 • Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg UV akan menunjukkan warna tertentu) • 8-Hidroksiquinolin-NH3 • Pengenal kation anorganik (dg UV akan terlihat berbagai warna) • Ninhidrin • Gugus amino akan berwarna biru.
Profil KLT fraksi aktif ekstrak daun pecut kuda (S. jamaicensis) Fase gerak : CHCi3 : MeOH : EtOAc (9:3:5) ; Fase diam = Silika Gel F254; H fraksi heksan, C fraksi kloroform, E fraksi etil
Reagen fosfomolibdat u/ deteksi senyawa terpenoid dan warna yg dihasilkan adlh hijau kebiruan. • Reagen H2SO4 u/ deteksi senyawa terpenoid yg akn mnghslkn warna spot coklat, hijau, kuning, merah atau biru. Pd perlakuan H2SO4 50% kmdn dipanaskan suhu 100-110oC selama 5 mnt,mnghslkn spot coklat
JENIS KLT A. KLT Preparatif • Tebal adsorben 1 – 1,5 mm (makin tebal, pemisahannya makin sulit) • Pengeringan adsorben harus optimal u/mencegah case hardening dan retak. • 2 ml sampel (50-250 mg) diaplikasikan dg cara menggariskan setebal 5-8 mm pada garis dasar (tidak smp merusak adsorben) • Cara visualisasi yg dipakai dg non destruktif, terutama dg UV, penyemprotan dg air atau uap iodium. • Komponen terpisah dikerok, diletakkan dlm corong dg kertas filter • Diekstrak dg pelarut yang polaritasnya sesuai.
B. KLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dg : • Analisa langsung pada plat, dengan : • Charring secara standar, kmd digunakan densitometer untuk menentukan kuantitasnya • Pengukuran radioaktivitasnya, khususnya senyawa yg ditandai dg radioaktif • Dengan neutron activation analysis • Gravimetri : masing2 komponen diisolasi, diekstrak, diuapkan dan ditimbang. • Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsional dengan spektrofotometer.
C. KLT dengan argentasi • U/ pemisahan senyawa yang mempunyai jumlah ikatan rangkap yang berbeda & isomer cis dan trans dr asam lemak. • Plat adsorben mengandung AgNO3 : • Mencelup plat KLT ke dalam larutan AgNO3 10-12%,atau • Menambahkan larutan AgNO3 dlm pembuatan larutan adsorben • Sistem pelarut campuran heksan eter dg proporsi yg bervariasi tergantung jumlah ketidak jenuhan senyawanya • u/ memisahkan monoenoat (ik. Rangkap 1) = 93 : 7 • u/ dienoat (ik. Rangkap 2) = 83 : 17 • u/ monoena, diena, triena, tetraena, pentaena, heksaena dari metil esternya = 60 : 40.
Komponen lipida polar kacang tanah yg dipisahkan dg TLC dua dimensi I. Kloroform : Metanol : 28% amonia = 65 : 25 : 5 (v/v) II. Kloroform : Aceton : Metanol : HAc : Air = 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5 (v/v) X1, X2, X3, X4, tidak diketahui; PE = Fosfatidil etanolamin, PI = Fosfatidil Inositol, PS = Fosfatidil Serin, LPE = Lisofosfatidil Etanolamin, LPC = Lisofosfatidil Kolin dan PA = Asam fosfatidat