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Neues aus der Sepsis-Diagnostik

> Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < . Neues aus der Sepsis-Diagnostik. Petra Apfalter. Klinische Mikrobiologie AKH Wien. Kennen Sie dieses Szenario?. Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient Infektion? Sepsis = SIRS durch Infektion Wenn ja, welche?

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Neues aus der Sepsis-Diagnostik

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  1. > Wiener Intensivmedizinische Tage 2006 < Neues aus der Sepsis-Diagnostik Petra Apfalter Klinische Mikrobiologie AKH Wien

  2. Kennen Sie dieses Szenario? • Fiebernder, vortherapierter ICU-Patient • Infektion? • Sepsis = SIRS durch Infektion • Wenn ja, welche? • Gefragt wäre rasch ein relevanter Befund • Erreger, Empfindlichkeitsprofil

  3. Warum ist Sepsis-diagnostik wichtig? • Haupttodesursache auf nichtkardiologischen ICU • Direkte Behandlungskosten in D: 1,1 bis 2,45 Milliarden Euro/Jahr • Therapie oft empirisch • 11% - 46% ICU Patienten initial falsch therapiert 1, 2, 3 • Zeitfaktor essentiell für Outcome • Letalität hoch (40%) 1 Kollef M, Chest, 1999 2 Garnacho-Montero J, CCM, 2003 3 Byl B, CID, 1999

  4. Von welchen Infektionen geht eine Sepsis am häufigsten aus? • Lunge 44.0% • Harnwege 9.1% • Bauchorgane 8.6% • Wunden und Weichteile 6.6% • Katheter 2.2% • ZNS 0.8% • Herzklappen 0.6% • Andere (z.B. Sinus) 10.8% • Bakterien im Blut (positive Blutkultur) 17.3% (Angus DC, Crit Care Med 2001; 29:1303-1310)

  5. Anteil positiver Blutkulturen AKH Wien 2005 Krankenhaushygiene, AKH Wien

  6. Worum es heute geht • Konventionelle Diagnostik • Blutkultur (BK) • Diagnostik - Neu • PNA-FISH aus BK • Light Cycler®SeptiFAST aus EDTA-Blut • rDNA-Sequenzanalyse • Diagnostik - In Entwicklung • Chip-Techniken

  7. Blutmenge ist DER entscheidende Faktor! Bakteriämie: Erwachsene <1-10 KBE/ml Kinder 10->100 KBE/ml Gesamtvolumen: 15-20 ml (Kinder 1-5 ml) Standard: 1 aer. + 1anaer. Fl. od. 2 aer. Flaschen Alt, aber gut: die BK

  8. Wann BK abnehmen? • Möglichst früh bei Symptomen, die auf eine Sepsis hinweisen • Vor Behandlungsbeginn, ansonsten am Ende eines Antibiotika – DI • 2-3 Kulturen in rascher Folge • Bei negativem Ergebnis nach 24h WH! • Keine „Überwachungs-BK“ • Keine „follow-up“ BK nach Diagnosestellung

  9. Diagnostischer Zeitrahmen BK Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren Blutkultur ID + AB Gram

  10. Worum es heute geht • Konventionelle Diagnostik • Blutkultur (BK) • Neu • PNA-FISH aus BK • Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut • rDNA-Sequenzanalyse • In Entwicklung • Chip-Techniken

  11. PNA-FISH • PeptideNucleicAcidFluorescenceInSituHybridization • Fluoreszierende PNA Sonde hybridisiert mit ribosomaler RNA • Blut-Kultur Identifikation in 2.5 h • Für in vitro Diagnostik

  12. Diagnostischer Zeitrahmen PNA-FISH vs. BK: - 1d Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren ! Blutkultur ID + AB Gram

  13. PNA-FISH: Target rRNA Hoch konserviert 103-105 Kopien/Zelle (natürliche Amplifikation) rRNA Sequenzen = taxonomische Referenz

  14. Schnell-ID positiver BK S. aureus PNA FISH GPCC C. albicans PNA FISH Gram Fbg. Yeast GPCPC E. faecalis PNA FISH

  15. Light Cycler® SeptiFAST aus EDTA-Blut Diagnostics • Multiplex Real-time PCRam Light Cycler 2.0 (Roche)

  16. The LightCycler SeptiFast TestHypothesis: DNA in human blood? Diagnostics PCR Kultur freie DNA lebende Bakterien/Pilze lebende Bakterien/Pilze tote Bakterien/Pilze phagozytierte Bakterien/Pilze lebende, phagozytierte Bakterien/Pilze (?) human DNA

  17. The LightCycler SeptiFast TestTarget Region – Internal Transcribed Spacer Diagnostics Multiple specific HybProbe probes • Spacer Region (ITS*) • Multiple copies • Well investigated • Especially suited for Species testing • Ribosomal Genes • Multiple copies • Well investigated • Especially suited for Group testing • Single Copy Genes • No enhancement • Less investigated * ITS = internal transcribed spacer

  18. Das HybProbe Prinzip • 2 Sonden = benachbart hybridisierendes Oligopaar • Signal (FRET) nur wenn beide nebeneinander binden • Sequenz-spezifische Detektion + • Mutationsanalyse in der Hybprobe-Targetsequenz durch Schmelzkurvenanalyse möglich!

  19. Extraction The LightCycler SeptiFast TestNegative Control / Internal Control Sample or Negative Control Diagnostics - MagNA Lyser Instrument - Sample Preparation Lysis Internal Control Purified NA 50 µl eluate each LightCycler Instrument The LightCycler SeptiFast Kit Gram (-) Gram (+) Fungi

  20. Channel610 S. spp. from SML (610) S.spp CoNS from SML Staphylococcus aureus Channel640 CoNS S.aureus S. spp from SML (670) Streptococcus pneumoniae Channel670 S.spp S.pneu Channel705 Internal ControlEnterococcus faeciumEnterococcus faecalis IC E.fum E.fis t [°C] The LightCycler SeptiFast TestChannel distribution Gram (+) Diagnostics

  21. Enterococcus faecium • Enterococcus faecalis SeptiFast Master List Gram (-) Gram (+) Fungi • Staphylococcus aureus • Escherichia coli • Candida albicans • Candida tropicalis • Candida parapsilosis • Candida glabrata • Candida krusei • Aspergillus fumigatus • Klebsiella • (pneumoniae/oxytoca) • CoNS 1 • Strep. pneumoniae • Streptococcus spp.2 • Serratia marcescens • Enterobacter • (cloacae / aerog.) • Proteus mirabilis • Pseudomonas aeruginosa 1 Coagulase Negative Staphylococci (Species which represent the group are listed in the PI). 2 Species which represent the group Streptococcusspp. are listed in the PI. 3 Species referred as A. calcoaceticus- A.baumannii are not detected. • Acinetobacter baumannii 3 • Stenotrophomonas • maltophilia • Each bullet point represents a specific melting point, species in brackets are not differentiated

  22. % 46 50 45 E. coli 9%Klebsiella 5%Enterobacter 3% 40 35 30 21 25 20 15 6 6 5 4 10 2 5 0 Andere Candida Enterokokken Pseudomonas Enterobakterien Streptokokken Staphylokokken Keimspektrum AKH Wien 2005 Sepi 25%Sau 12% Krankenhaushygiene, AKH Wien

  23. Empirische AB-Therapie Anpassen – De-Eskalieren ! Blutkultur 6 h ID + AB SeptiFAST Gram

  24. rDNA-Sequenzanalyse • Real-time PCR + Sequenzierung

  25. rDNA-Sequenzanalyse • 16S rDNA für Bakterien • 18S, 28S rDNA & ITS1 & 2 Region für Pilze • Direkt von Patientenprobe • Amplifikation mit universellen Primern • Sequenzieren der Amplicons • Alignment mit Datenbank

  26. Zielgene Real-time PCR-Amplifikation 16S rDNA • Universelle Primer rDNA Operon 16S rDNA = universelles bakterielles Gen Konservierte Regionen … Primertarget Hypervariable Regionen (zB V3) … Phylogenetische Analyse

  27. Überblick Sequenzreaktion Sequenzreaktion & Aufreinigung • MicroSeq Komponenten • dRhodamine dyeTerminatoren, cycle sequencing A dR6G T C G dROX dTAMRA dR110

  28. Analyse der Daten Editieren der Sequenz

  29. TechnikAnfordern: Besuchen Sie uns!http://www.meduniwien.ac.at/akh/klinischemikrobiologie

  30. Worum es heute geht • Konventionelle Diagnostik • Blutkultur (BK) • Neu • PNA-FISH aus BK • SeptiFAST aus EDTA-Blut • rDNA-Sequenzanalyse • In Entwicklung • Chip-Techniken

  31. Microarrays • Detektion hunderter Mikroorganismen simultan (100.000e Gene) • Detektion wichtiger Resistenzgene • Bestimmung von verschiedenen Genotypen, Mutationen • Quantifikation möglich

  32. Oligo-shotgun-Chip Austrian Research Center Seibersdorf Cloning of interesting genes inE.coli ( plasmids) genomic 16S rRNA gene- fragments Amplicons(oligos) of all gene fragments spotted onto chip = probes Patterns of green spots identifyspecies + resistence present in sample Hybridization DNA* extraction from specimen (*incl. unknown bacterial DNA) -> PCR (whole bacterial DNA tagged with Cy3)

  33. Diagnostischer Peptidchip • Anwendung in Körperflüssigkeiten • Simultane Detektion verschiedener Erreger & Resistenzen:Protein/Epitop am Chip detektiert spezifische Immunantwort

  34. Funded by: Co-Operate Vienna Wiener Wirtschaftförderungsfond Peptidchip - Strategie • Prediction of BacterialAntigens in silico • Whole genome • B cell epitopes • Collection of Sera • Sera from patients (with bacterial infections) • Sera from healthy persons • Bacterial Epitope Identification • Peptide Synthesis • Peptide ELISA with Sera • Validation of Antigens • Peptide ELISA • Peptide Chip

  35. Take home message: Besuchen Sie uns!http://www.meduniwien.ac.at/akh/klinischemikrobiologie

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