KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA

1. KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA Any Guntarti

2. Kromatografi Kolom Sederhana Bergerak / aliran karena gaya grafitasi ↓ Pemilihan fase diam + fase gerak ↓ Kepolaran ↓ Pita-pita kromatogram ↓ Terbentuk fraksi-fraksi ↓ Dianalisis dengan KLT / KK↓

3. Pemisahan Secara Kromatografi Mikhail Tswett ↓ Pigmen tumbuhan ↓ Pita-pita

4. Pengisian Kolom • fase diam homogen • fase diam ukuran sama • fase diam bentuk seragam • bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

6. Kolom kromatografi sederhana (learning kolom)

7. Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5:2,5:0,4 Isolat yang diambil Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

8. Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4 A: isolat hasil isolasi I B: isolat hasil isolasi II A B Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm. fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

9. Hasil spektra Spektrofotometri UV

10. Hasil spektra Infra Red

11. Gambar. berbagai metode pemisahan Termometer • Contoh: a b c d 3 2 1 d 2 3 4 1

12. Klasifikasi Sistem Kromatografi

13. SKALA PRIORITAS / DERET ELUOTROPIK Kekuatan / E0 Pelarut n.Pentana Iso oktana Siklo hexana CCl4 Xylena Toulena Benzena CHCl3 Aseton Etil asetat Anilin Asetonitril Iso propanol Etanol Metanol Asam asetat 0 0.01 0.04 0.18 0.26 0.29 0.32 0.40 0.56 0.58 0.62 0.65 0.82 0.88 0.95 besar

14. Kromatografi Fase diam fase gerak ↓ ↓ Statinary phase mobile phase Pemisahan ↓ Perbedaan laju migrasi Polaritas senyawa

15. Hukum Distribusi Kromatografi↓perbedaan distribusi komponen di dalam FG & FD↓koefisien distribusi / partisi (K)↓K = CS /CMCS : kons. Molar komponen dlm FDCM: kons. Molar komponen dlm FG

16. Secara ideal : CS & CM ↓ kurvalinier CS Macam-macam bentuk kesetimbangan CS & CM D CS B A 0 C CM CM Kurva A : ideal → tidak saling campur → kromatografi Linier B/C : ada asosiasi & desosiasi D : ada reaksi isoterm adsorpsi ↓ Kromatografi → cenderung kurva A → konsentrasi relatif rendah

17. Elusi dalam kolom kromatografi Elusi : proses terbawanya komponen dlm suatu camp, shg ada pemisahan komponen yg dibawa oleh FG dari ujung atas kolom → bawah tR : waktu yg diperlukan oleh komponen untuk bermigrasi sepanjang kolom Vr : volume FG yg dibutuhkan untuk membawa komponen dari titik awal kolom → akhir kolom Solvent Sp E B + E E kolom A + E E D signal tR

18. F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per satuan waktu ↓ F = VR / tR tR = VR / F Dalam kolom yang ideal ↓ Komp. yang tidak teretensi ↓ t = 0 ↓ Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi → tM : waktu FG melewati kolom VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen → tR’ = tR – tM VR’ = VR – VM terkoreksi

19. Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada 2 macam teori : • Teori Lempeng (Plate Theory) ↓ Martin & Synge (1941) ↓ Efisiensi kolom ↓ Apabila jumlah kesetimbangan makin besar → efisiensi >> → menambah jumlah lempeng (N) → tebal lempeng teoritik → H N & H → menyatakan efisiensi ↓ Secara matematis : N = L / H Kelemahan teori : tidak mampu mengidentifikasivariabel-variabel yang mempengaruhi pelebaran pita kromatogram

20. 2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory) Dapat mengatasi kelemahan teori Plate. → teori laju / rate theory ↓ Partikel komponenbermigrasi diantara FG & FD ↓ Migrasi sangat tidak teratur ↓ Energi thermal ↓ Gerakan partikelnya random ↓ Ditribusi simetrik Gauss

21. H.E.T.P H = 16 L x (Wb / tR)2 N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2 Simetrik Gauss → t (waktu) lama →puncak lebar

22. Menurut Van Deemter ↓ Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju migrasi komponen diantara FG & FD : • Difusi Eddy (Eddy diffusion) • Difusi longitudinal (longitudinal diffusion) • Proses transfer massa ↓ Pada tebal lempeng teoritik (H) → merupakan fungsi linier variabilitas laju migrasi komponen ↓ Persamaan Van Deemter H = A + B /µ + C.µ A = koefisien Difusi Eddy B = koefisien Difusi longitudinal C = (CS + CM) = koefisien total

23. Difussi longitudinal ↓ Pelebaranpita ↓ Molekul komponen dlm FG → bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah ↓ Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara hiperbolik terhadap kenaikan kecepatan linier FG (µ) ↓ Pada tebal lempeng teoritik DM = koefisien difusi komponen FG Ψ = kualitas packing FD ↓ 0,6 2ΨDM B HLD = = µ µ

24. Pelebaran pita Transfer Massa ↓ Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik ↓ Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses transfer massa → pemisahan rendah • Pelebaran pita diffuse Eddy ↓ Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom ↓ Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang

25. B Composite curve C standar H. Opt C mobile H H min A Proses migrasi H = A + B / µ + C.µ → Persamaan Van Deemter

26. tA Sinyal analitik tM • Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalamiretensi & tidak 0 t (waktu) W konsentrasi B A Jarak migrasi • Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada • jarak migrasi yang berbeda

27. tR V = x µ tM VARIABEL TERMODINAMIKA PADA PEMISAHAN Mempengaruhi kualitas kolom • Waktu Retensi 2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k’) Ratio jumlah molekul komponen dalam FD terhadap jumlah molekul komponen dalam FG Laju migrasi komponen

28. nS [ CS x VS ] k’ = = nM [ CM x VM ] VS k’ = x k VM tR’ ( tR – tM) k’ = = tM tM Lanjutan… Pengalaman : k’ < 1 ↓ Tidak memisah Disarankan : k’ semakin besar ↓ Pemisahan ↑ ↓ k’ > 10 ↓ Tidak ekonomis

29. 3. Faktor selektivitas (α) ↓ Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan dipisahkan ↓ Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom ↓ α = KB / KA KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi kuat dalam kolom KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi lemah dalam kolom

30. (tR)B - tM α = (tR)A - tM Ada hubungan dengan k’ ↓ α = KB’ / KA’ ↓

31. ΔZ 2 ΔZ RS= = 0,5WA + 0,5WB ( WA + WB ) ( α – 1) VN k’B RS = x x α ( 1 + k’B ) 4 2 [ (tR)B – (tR)A ] RS= WA + WB 4. Resolusi Kolom (Rs) ΔZ = jarak puncak A & puncak B WA = lebar dasar kromatogram A WB = lebar dasar kromatogram B Disarankan RS ≥ 1,5 ↓ Hubungan dengan faktor-faktor lain

32. Semoga Bermanfaat ...

33. Sesungguhnya sedekah itu dapat menghilangkan murka Alloh & dapat menghilangkan kematian yang buruk(HR. at-Tirmidzi)

34. Any Guntarti KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

35. SKEMA HPLC Injektor Kolom analitik C18 D Ke penampungan POMPA Integrator

38. Instrumen HPLC

39. Reservoir Fase Gerak ↓ Bisa lebih dari 1 ↓ dari gelas / stainless steel ↓ Daya tampung 1- 2 L Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di dalam kolom & detektor ↓ - Pelebaran pita analit - Respon detektor terganggu

40. Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir & diaduk / dipanaskan • Solven disaring dengan kertas Millipore • Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan → Elusi Isokratik • Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda → Elusi Gradien • Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang reprodusibilitas optimum dalam pemisahan

41. 2. Pompa • Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi) • Kec. Alir 1-3ml/menit • Bahan harus resisten secara kimiawi Ex : dari teflon & stainless steel • Tidak ada pulsa getaran • Kontinyu

42. 3. Peredam Pulsa Fase Gerak • Ada beberapa detektor sensitive terhadap variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi, elektrokimia & konduktometer • Peredam aliran dengan gas yang ditekan

43. 4. Sistem Injeksi Sampel • Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas sampel • Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil • Konvensional atau automatik

44. Injektor Automatik

45. 5. Kolom Kromatografi • Bentuk tabung, permukaan dalam rata • Dari gelas / stainless steel • Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FG • Sambungan kolom → tidak menyebabkan FG stagnant • Panjang kolom (10 – 30) cm • Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm • Internal diameter (4 – 5)mm • Partikel diameter (3 – 5) µm • Guard kolom → sebelum kolom analitik

46. Kolom dari stainless steel

48. 6. Detektor Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan ↓ Harus sensitif (menghindari pelebaran) Ada 2 macam : • Berdasarkan sifat umum larutan • Refraktif indeks → control temperatur • Kurang sensitive

49. 2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel • UV – Vis • Fluorescence • Elektrokimia ↓ Sinyal analit yang berbeda dari FG ↓ Lebih sensitif (µg – ng) ↓ Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom

50. Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC tempat injeksi kolom Detektor 0.506 1.50 kapiler bentuk koil Pompa Pompa sampel pereaksi penampung Fase gerak pereaksi