Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty Bobovčák M., Klinické laboratórium VVÚCHP, Nová Polianka, Vysoké Tatry , Slovensko

BDT / BAT – funkčný test - FC – (Saint-Laudy 1994) - Alergie - Typ I hypersenzitivita (IgE) - Pseudoalergie - nonIgE, komplement, IgG, TypII,III , auto anti- IgE - Nezachytáva Typ IV – bunkami sprostredkovaná hypersenzitivita Princíp Periférne Leu (WB) + stimulans v aktivačnom pufri + Inkubácia detekcia expresie CD63(gp53) na FC identifikovaných bazofiloch Basotest Orpegen FlowCast Bühlmann BD FastImmune BD 100 ul WB heparín Izolované Leu 50 ul ACD, EDTA 100 ul WB heparín Vzorka BSB/Stimul 20/100 ul 0/50 ul 0/20ul 40 min 10 pred/20 min 10 –15 min Inkubácia N-FMLP FcεRI N-FMLP Pozitívna K EDTA?+Chlad/ Lýza Ľad / Lýza Ľad or EDTA/ Lýza Stop/Lýza CD63-FITC/ IgE-PE CD63/ CD123/DR Farbenie IgE-Fitc/CD63-PE

Cieľ: metodický postup pre optimálny BDT pre vyšetrenie alergie a pseudoalergií (liečivá) BDT – predanalytická fáza Pacient: vysadenie liekov – 14 dní steroidy, 48 hod. anti-histaminika/leukotriény Odber: heparín, štandardizovaný (5-7ml vacutainer a pod.) do 4 (24?) hod. (sklo, plast, laminárny box, sedimentácia plnej krvi na gradiente 1077 3ml/3ml 40-50 min, odpipetované: 800 ul plazmy) Izolované Leu centrifugačne Mononukleáry gradient Plazma heparín Plná krv ++++ +++ ++++ + Jednoduchosť Nešpecifická Stimulácia+TR + ++ ++++ + Interakcie (Liečivá) Ery,Tr proteíny Ery,Tr Tr Tr proteíny ++++ ++++ Farbenie + FC ++ +++

BDT – reakčné pomery - postup Apyrogénne, sterilné, 2 ml skúmavky EPP /otestovať/ , laminárny box 50 ul - Stimulačný pufer BSB (NC), - 1ug/ml a-IgE(De2), 2uM N- FMLP (PC), - stimulans / alergén v BSB BSB = 20mM HEPES, 5 KCL,133 NaCL, 7 CaCl2, 3.5 MgCl2, 1 mg/ml HSA pH 7,4 (proTK ) 10 ul r IL3 v BSB 10ng/ml zvyšuje senzitivitu (literatúra) 50 ul heparínovej plazmy / KO – analyzátor / INKUBÁCIA 37oC, vodný kúpeľ 20 min silné alergény (inhalačné, potraviny... ) 40 min slabé alergény (liečivá... ) (kontrolný pacient) STOP: ľadový kúpeľ 5 min. FARBENIE protilátkami: 25-30 min. na ľade PREMYTIE pufrom WB = 0,1 % BSA v PBS 1,5 ml RESUSPENDOVANIE 600ul WB – AKVIZÍCIA - FC (300 – 500 - 1000 bazofilov)

Negatívna kontrola BSB – do 10% CD63+Bazo n=30 spontánna stimulácia / vylúčenie nešpecifickej stimulácie / n=15 % CD63+ Bazo

Pozitívna kontrola • Anti IgE(De2) 70%-90% CD63+Bazo ( 25% nonresponder) • N – FMLP peptid 30%-60% CD63+Bazo • Anti IgEeRI ? - výhodnejšie ako anti IgE (5% nonresp. Lit.) NC - pufer PC – a-IgE CD63 Fitc CD63 Fitc SS SS

Stimulans / Alergény Silné alergény : inhalačné, potraviny, latex, jedy /insekty/ • veľmi dobrá korelácia s inými testami aj s BDT z plnej krvi u latexu vynikajúca. • Komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann Použiteľné Stallergen, Sevapharma ! PNU jednotky • Kritická : 1.čistota /!!!! aditíva ako azid, mertiolát, fenoly interakcia s bielkovinami, trombo, ery... • 2.koncentrácia v teste musí byť predtestovaná !!! S ohľadom: • - na senzitivitu – čo najvyššie percento CD63+bazofilov • - na špecifitu – pacient reaguje v závislosti od dávky, • nealergický pacient nereaguje pri danej konc. alergénu Slabé alergény : liečivá a pod.= nízka odpoveď CD63+Bazo • Senzitivita lepšia pri použití izolovaných Leukocytov • komerčne dostupné pre BDT :napr. Bühlmann – literatúra , • Kritické!!! : Čistota, Koncentrácia - v teste využiľ kontrolu na negatívneho pacienta, pracovať vždy dávkovo /najmenej 2 koncentrácie/ a NC v duplikáte. • Interakcie – inhibícia BDT, s bunkami a bielkovinami • Použitie originálnych farmák. Vodítko www. Bühlmann.com • Testované u nás: • ACP, Ibuprofen, Penicilín G, V,Amoxicillin ,Ciprofloxacin Arduan, Norcuron

1.IgE+ bunky, intenzita farbenia klesá po aktivácii 2.CD203c + bunky, intenzita farbenia stúpa po aktivácii 3.CD123+ bunky BDT – identifikácia bazofilov Aktivácia 1.CD203c+ bazofily,mechanizmus upregulácie nejasný 2. CD63+ bazofily, enzymatická kaskáda pri aktivácii a degranulácii vedie k externalizácii intracelulárnych komplexov s transmembr. CD63 Protilátky aCD203c-PE ( 97A6) bazofily,mastocyty, megakaryoc. CD34+bb. - Immunotech aCD123 - PE (IL3Rα, 9F5) bazo, mono, Eo, dendritické bb. - BD aHLA DR- PCP (1.243, Bazo- Low SS, Eo- High SS), (B, Mono, dendrit.bb.+) - BD aCD63 – FITC (gp53, H5C6) akt. bazo, akt. Trombo, Monocyty,MF -PharMingen aCD45 – PC7 Pan Leu Trombo- , Ery - -Immunotech

63 / 203c / 45 versus 63 / 123 / DR / 45 WB CD203c PE CD203c PE 45+ CD203c PE WB Plazma SS SS SS CD203c PE 45+ CD123 PE 45+ CD123 PE 45+ DR- Plazma Plazma Plazma SS SS SS

Stratégia gatingu63-FITC/123-PE/HLADR-PCP/45-PC7 CD123 PE CD45 PC7 DR-PCP 1 2 Bazo Leu – Live Gate DR-PCP SS SS 3 FW CD63 Fitc CD123 PE Bazo Aktivované Bazo SS SS SS Live Gating CD45, Low SS, kompenzácia !!!

Pozitivita vs Negativita CD63 Fitc CD63 Fitc CD63 Fitc TopCast 666 bazo 91,0% PC – a-IgE 559 bazo 94,6% NC 514 bazo 2,0% SS SS SS 1 1 1 CD63 Fitc CD63 Fitc CD63 Fitc PC – FMLP 497 bazo 35 % PC – FMLP 754 bazo 7 % PC – IgE 700 bazo 8 % SS SS SS 3 3 2 Zodac, Flixonase, Seretide

Liečivá , Interakcia trombocytov CD63 Fitc CD63 Fitc CD63 Fitc NC 609 bazo 15% Ibuprofen 742 bazo 7% ACP 973 bazo 18% SS SS SS 1 1 1 Ibuprofen 345 bazo 14% CD45 PC7 CD62P Fitc 45+ CD63 Fitc 1 % 0,4 % 5% SS SS 2 Trombocyty, interakcia s liekmi, koagregáty s Leu, aktivácia

Reprodukovatelnosť IntraAssay CV % CD63+ Bazo Negatívne kontroly, triplikáty, n=10 - CV 15,9 % Pozitívne kontroly n=5, duplikáty – CV 4,3 % Hodnotenie– silné alergény% CD63+ Bazofilov NC<10%, PC(IgE) 70-90%, PC(FMLP) 30-70%, Stimul > 20% Hodnotenie– slabé alergény (liečivá) Stimulačný index SI=%akt.Bazo Test / %akt.Bazo NC Negatívne SI<1,3 Dubiózne SI= 1.3-2,0 Pozitívne SI>2,0 Negativita neznamená , že pacient nezareaguje klinicky ! !dávkový režim, duplikáty, optimalizovaná cc! !

Záver Prezentovaný Bazofilný degranulačný / aktivačný test vo vlastnej optimalizovanej modifikácii, v ktorom sme skombinovali aj niektoré výhody komerčne dostupných testov, je použiteľný pre testovanie hypersenzivity na silnejšie alergény , slabšie alergény i liečivá, za dodržania vyššie spomínaných odporúčaní. Je pracovne nenáročný a lacnejší ako komerčné sety.

Bazofilný degranulačný test na prietokovom cytometri metodické aspekty