Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 2 . GS , FCM, FISH/GISH

1. Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 2. GS, FCM, FISH/GISH Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

2. Velikost genomu • množství DNA v buňce • uvádí se v různých jednotkách: • pg [pikogram] DNA (= jednotka hmotnosti) • Mbp nebo Gbp (= počet bazí) • 1 pg ~ 978 Mbp (1Mbp = 106 bp) • 1 pg ~ 0.978 Gbp (1Gbp = 109 bp) • 1 Gbp ~ 1.022 pg (= 1 / 0.978) • pojem ovšem může znamenat velmi různé věci • užitečný údaj pro více účelů • taxonomie (odlišení druhů) • znalost velikosti genomu je potřebná při přípravě materiálu pro některé metody vyžadující „správné“ množství DNA

3. Holoploidní velikost genomu • 1C hodnota – obsah DNA v 1 buňce, která má jeden „chromosome complement“ (sada chromozómů, která při pohlavním rozmnožování jde od jednoho rodiče) = má nchromosomů • u mechorostů (a někt. řas) dominatní fáze, gametofyt • u cévnatých kytek (a spousty živočichů) pouze gamety • 2C hodnota – u cévnatých kytek (aj. diplofazických organismů) obsah DNA v jedné somatické buňce, která právě neprochází buněčným dělením, tj. má 2n chromosomů • právě toto se většinou rozumí pod pojmem velikost genomu • analogicky 3C (např. endosperm), 4C, 8C,… • nezohledňuje ploidní stupeň!

4. Holoploidní velikost genomu Příčiny změn • chromosomové přestavby • fúze / fragmentace celých chromosomů nebo částí • skokové nebo postupné • zvýšení i snížení • aktivita retroelementů • zvýšení • polyploidie • zvýšení, viz dále

5. Polyploidie • znásobení počtu chromosomů v buňce • chyby v meiose • přestavby na úrovni celého genomu • neredukované gamety • hybridizace • … resp. kombinace několika příčin • několik zásadně odlišných typů • významné důsledky pro populační genetiku, rekonstrukci fylogeneze,…

6. Auto- a allopolyploidie Autopolyploidie • chromosomy od jednoho předka • jednotlivé kopie „stejné“ • v hrubém pohledu, v detailu ne, pro daný lokus může existovat víc alel • náhodné párování v meiose, volná rekombinovatelnost alel

7. + Auto- vs. allopolyploidie Allopolyplodie • chromosomy od různých předků, polyploidizace spojená s hybridizací • jednotlivé kopie různé • chromosomy různého původu se nepárují • rekombinace alel pouze v rámci sady od stejného předka • v meiose se chová jako diploid • přechodné typy (segmentární allopolyploidie) • část (méně odlišných) chromosomů se páruje a rekombinuje,…

8. Neo- vs. paleopolyploidie Neopolyplodie • recentně vzniklá • všechny kopie chromosomů / lokusu přítomné • organismus se chová jako typický polyploid (auto- nebo allo-, viz výše) Paleopolyplodie • dávná polyploidizační událost • v průběhu evoluce dochází ke změnám genomu • funkční rozrůznění jednotlivých kopií genu • ztráta funkce jedné z kopií genu (ale v genomu přítomný) • úplná ztráta jedné z kopií (delece) • detekovatelná srovnávací analýzou celého genomu • u většiny krytosemenných 2-3 staré polyploidizace

9. Neo- vs. paleopolyploidie Paleopolyplodie • organismus se chová jako diploid • evoluční tlak na odstranění redundantních kopií → diploidizace • např. v evoluci většiny liníí krytosemenných několik cyklů polyploidizace a následné diplodizace • závažné důsledky zejména pro fylogenetiku • ortology (homologní kopie genu, tj. fyzicky ležící na stejném místě v genomu) • paralogy (nehomologní kopie, tj. na různých místech genomu ležící kopie původního genu vzniklé duplikací) • fylogenetické metody předpokládají, že pracujeme s ortology • …ale nemusí být jednoduché to rozlišit

10. Monoploidní velikost genomu 1Cx hodnota • velikost (pg nebo Mbp) jedné chromosové sádky • pro diploida: 1Cx = 2C / 2 • pro tetraploida 1Cx = 2C / 4 • pro pentaploida 1Cx = 2C / 5 • … atd. • umožňuje srovnání mezi ploidiemi • obvykle s rostoucím ploidním stupněm klesá, někdy i poměrně výrazně („genome downsizing“)

11. Průtoková cytometrie • Flow cytometry, FCM • spíše cytologická než molekulární metoda • ale děláme ji u nás v laboratoři… • měří obsah DNA v jádře = velikost genomu • umožňuje odhadnout ploidii / počet chromosomů, což je často nezbytné pro interpretaci výsledků molekulárních metod! • vypovídá o genomu v nejhrubším měřítku • velikost • počet kopií chromosomů • lze odhadovat i zastoupení bazí (AT vs. GC) na úrovni celého genomu

12. Průtoková cytometrie • cytometrie= metoda umožňující sledovat vlastnosti optické částic (buňky, buněčná jádra) • intenzita fluorescence • rozptyl světla • průtoková= sledované částice v suspenzi, při průtoku měřící kyvetou • velmi často používaná v medicíně (běžná diagnostická metoda) • použití v botanice / zoologii jen výsekem možných aplikací

13. Vzorky • suspenze sledovaných částic • krev, hemolymfa,… • voda (plantkton,…) • a u kytek co? jak to dostat z buněčné stěny ? • chemické narušení → protoplasty • izolace jader • izolace buněčných jader u rostlin (cca 5 min.) • nasekání tkáně žiletkou v izolačním pufru • stabilizace jader (vhodné pH, osmolarita, antioxidanty,…) • detergent (snižuje slepování jader) • přefiltrování (tkanina 42 μm) • přidání fluorescenční barvy (pokud není součástí izolačního pufru)

14. Vzorky • Obvykle analyzované tkáně • čerstvé listy, stonky, květy,… apod. • semena • vysušené tkáně (silikagel) • nepredikovatelné posuny fluorescence, lze použít jen orientačně – určení ploidie • fixovaná jádra (glycerol apod.) ?

15. Průtokový cytometr

16. Průtokový cytometr vzorek kyveta zdroj světla • laser • UV lampa / UV dioda fluidika • pumpa • sheath fluid optika + počítač odpad

17. Fluorescence • barviva vázající se na DNA • propidium jodid (PI) – interkalační, nespecifické • DAPI – vazba na AT páry • příp. jiná barviva specifická pro GC páry (např. mitramycin) • výsledek vždy porovnáván s vnitřním standardem • rostlina o známém obsahu DNA, zpracovávaná společně se vzorkem • zobrazujeme jako histogram • poměr průměrů / mediánů píků • koeficient variance („šířka“ píků) • počet buněk

18. Centaurea 157.92 Glycine 189.46 poměr 0.833 Glycine 2.50 pg Centaurea = 2.50 * 0.833 = 2.08 pg Výpočet velikosti genomu • poměr mezi fluorescencí vzorku a standardu • absolutní • barvivo PI • vyjadřuje se v pg nebo Mbp, 1 pg = 978 Mbp • obvykle průměr ze 3 měření jedince • relativní • barvivo DAPI • standard = 1 • vhodná např. pro určení ploidie • přesnější a méně jedovaté než PI • porovnáním obou lze spočítat obsah bazí AT / GC Centaurea weldeniana+* Glycine max ‘Polanka’

19. Výhody / nevýhody Výhody • nedestruktivnost • obvykle nejsou potřeba speciální tkáně (× karyologie) • rychlost, statisticky robustní data na populační úrovni • cca 100 vz. za den, někdy lze analyzovat více jedinců / vz. • přesnost, detekce drobných rozdílů a vzácných cytotypů • cena Nevýhody • většinou potřeba čerstvého materiálu • problémy se sekundárními metabolity, slizy,… + analýza pylu • omezená citlivost při vyšších chromosomových počtech (detekce aneuplodie, B-chromosomy apod.) • stanovení chromosového počtu jen nepřímé

20. Aplikace FCM v botanice Analýza ploidního stupně • ploidii odhadujeme nepřímo z velikosti genomu,nutná kalibrace klasickým počítáním! • taxonomický znak • Centaurea phrygia – diploid, C. erdneri – tetraploid; morfologicky ale velmi podobné • biologie polyploidů • rozšíření cytotypů, geografické, ekologické,… rozdíly • detekce meziploidní hybridů a vzácných cytotypů (např. nových polyploidů) • detailní studie smíšených populací (prostorové rozmístění, vazba na mikrostanoviště, hybridizace, kompetice, změny zastoupení cytotypů v čase,…)

21. Aplikace FCM v botanice Velikost genomu • taxonomický znak (2C) • odlišení taxonů se stejným počtem chromosomů, detekova-telné i drobné rozdíly, od 3 – 4 %) – např. Melampyrum • „vystopování“ původu polyploidů (různé „součty“ možných předků) • skupiny příbuzných druhů (např. několik „základních“ Cx-hodnot, které jsou stabilní mezi ploidiemi – Batrachium) • obecnější biologické závislosti • redukce Cx hodnoty se stupněm ploidie • vztahy velikosti genomu k délce životního cyklu, prostředí (nadm. výška, ostrovy, zeměpisná šířka), vlastnostem druhu (invazivnost,…) ale pozor na design těchto studií, obvykle problematický

22. Aplikace FCM v botanice Reprodukční systém, hybridizace • u krytosemenných dvojité oplození • embryo 2C (1C ♀ + 1C ♂) • endosperm 3C (2 * 1C ♀ + 1C ♂) • jiné poměry v případě odchylek(apomixie, neredukované gamety) • viz grafy – Sorbus (data M. Lepšího) • hybridizace diploida a tetraploida,vzniklo 3x semeno na diploidovi:(a) hybrid nebo (b) autopolyploid ? a) 2 * 1C(♀) + 2C(♂) = 4C b) 2 * 2C(♀) + 1C(♂) = 5C embryo 2C (2x) endosperm 3C (3x) normální sexualita Bellis perennis embryo 2C (4x) Bellis perennis endosperm 6C (12x) pseudogamie, neredu-kované embryo i pyl

23. Další aplikace FCM • studium planktonu • detekce hlavních skupin (bakterie, sinice, zelené řasy) • kombinace několika parametrů – velikost genomu, autofluorescence chlorofylů, specifické barvy pro bakterie,… • lze i kvantitativně – stanovení počtu buněk / koncentrace • analýzy chromosomů, genomika • medicínské aplikace • analýza buněčného cyklu (nádorová bujení apod.) • přítomnost antigenů pro danou protilátku,… • třídění buněk (sorting)

24. In situ hybridizace (FISH/GISH) • metody na rozhraní karyologie a molekulární biologie • preparát mitotických (příp. i meiotických chromosomů) • pevné přichycení na mikroskopické sklíčko • denaturace DNA (formamid + další chemikálie) • hybridizace biotinem značené sondy (probe), tj. DNA ze zájmového druhu / genu, atd. • zároveň obvykle zablokování častých repetitivních sekvencí, které by mohly překrýt signál sondy, apod. • fluorescenční značení sondy • při FISH nespecifické obarvení chromosomů jinou fluorescenční barvou, typicky DAPI (counterstaining) • analýza preparátu pod fluorescenčním mikroskopem

25. In situ hybridizace (FISH/GISH) FISH– fluorescent in situ hybridization • jako sonda slouží nějaká krátká sekvence • vybraný gen / úsek DNA • repetitivní sekvence (včetně mikrosatelitů) • sleduje se výskyt sondy (= komplementární sekvence) na jednotlivých chromosomech GISH– genomic in situ hybridization • jako sonda slouží celková DNA zájmového druhu • typicky u polyploidů a hybridů, sleduje se barvení celých chromosomů / jejich částí → původ od daného druhu • používáno hlavně u úžitkových rostlin a umělých hybridů (hlavně GISH), pro divoké druhy zatím málo

26. FISH Carmona et al. 2013, Ann. Bot. 112: 1845-1855 • Hordeum marinum, dva 2x poddruhy + 4x, morfologicky nerozeznatelný od 1 z diplodů • původ tetraploidů – auto vs. allopolyploidie • celkem 7 fluorescenčních sond • jednoznačné odlišení všech chromo-somů (karyotyp) • jeden 2x poddruh uniformní, v druhém určitá variabilita (stř. vs. Z Mediterán) • 4x má dvě dílčí sady chromosomů →allopolyploid, jedna sada identická s morfologicky stejným 2x, druhý rodič neznámý (varianta druhého 2x?)

27. GISH Renny-Byfield et al. 2010, Ann. Bot. 105: 527-533 • učebnicový případ allopolyploidizace: S. maritima 6x Eur × S. alterniflora 6x N.Am → S. ×townsendii 6xS. ×townsendii 6x steril. → S. anglica 12x fertil., invazní • detailní průzkum původních lokalit s výskytem kříženců • objev 9x rostlin • GISH ukazuje zastoupení genomů AAM(~ 60 chromosomů S. alterniflora žlutě, ~ 30 chromosmů S. maritima červeně) • asi zpětní kříženci • asi je to složitější, možný další genovýtok mezi taxony