Microscopies optiques appliquées à la biologie

1. Microscopies optiquesappliquées à la biologie Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2. Plan du cours • Introduction • Le microscope comme instrument optique • Méthodes de contraste en transmission • Fond clair • Contraste de Phase • Contraste interférentiel • Microscopie de fluorescence • Microscopie non-linéaire

3. Microscopie : Introduction Qu’est ce qu’un microscope? Instrument qui: - donne une image grossie d’un petit objet (grossisement) - sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution) - rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

5. Source de lumière Agents de contraste Optique Détecteur Laser Lampe UV … Absorbants Diffusants Dépolarisants Fluorescents … Objectifs Lentilles … Caméras Photodiodes …

6. Formation des images dans un microscope avec objectif corrigé à l’infini Schéma simplifié L’objectif et une lentille de tube forment un système afocal => grossissement g1 = ftube/fobj L’image intermédiaire est au voisinage du plan focal objet de l’oculaire L’oculaire travaille sur cette image comme le ferait une loupe : grossissement g2 =D/foculaire D : Distance conventionnelle (25cm, distance minimale de vision distincte) ftube : en général 160 mm

7. B. Grossissements Objectifs. Grandissements g1 faibles (2,5 à 10), moyen (15 à 25), ou fort (>40), en général les objectifs 60x et 100x sont à immersion. Oculaires. Grossissements normalisés g2: 6.3x, 10x, 16x, 25x Grossissement du microscope G = g1.g2

8. Les Objectifs de Microscope Élément le plus important du microscope, détermine la qualité de l’image qu’on peut obtenir (forme l’image primaire)

9. Aberrations optiques • aberrations chromatiques • aberrations sphériques • aberration de coma • astigmatismes • courbure de champ

10. III. Aberrations des lentilles A. Aberration chromatique Focale f’ vérifie 1/f’ = (n-1)(1/R1-1/R2) l’indice n dépend de la longueur d’onde l de la lumière qui traverse le verre => f’ dépend de l ! Pour une lentille convergente : Pour une lentille divergente, foyer bleu et rouge inversés… Correction : association de deux lentilles, une lentille convergente (Crown) et une lentille divergente (Flint) : achromat, ou doublet achromatique.

11. B. Aberration sphérique • Lentilles simples : un ou plusieurs dioptres sphériques.Les rayons lumineux • qui passent à la périphérie ne convergent pas au même endroit • que les rayons qui passent au voisinage de l’axe • l’image d’un point source n’est pas un point, mais une tâche définie comme le « cercle de moindre confusion ». Conséquences : diminution du contraste et de la résolution (image floue) • Correction des aberrations sphériques : • limitation des bords des lentilles (diaphragme d’ouverture), • lentilles non sphériques (difficiles à usiner, peu usitées) • association de lentilles de courbures différentes (doublet, triplet).

12. C. Aberration de coma Image d’un point hors axe optique apparaît comme une comète. S’observe lorsque la lentille n’est pas perpendiculaire à l’axe optique. Corrections : lentille perpendiculaire à l’axe, lentille diaphragmée, association de lentilles.

13. Image d’un point hors axe apparaît comme un bâtonnet; deux foyers dus à l’asymétrie du montage. D. Astigmatisme Corrections : lentille diaphragmée, association de lentilles.

14. E. Courbure de champ L’image d’un plan n’est pas un plan, mais une surface sphérique concave (lentille convergente) ou convexe (lentille divergente). Correction : association de deux lentilles. Conclusion. Toutes ces aberrations peuvent être corrigées par association de lentilles et/ou traitement des surfaces : objectifs de microscope compliqués, fragiles et coûteux.

15. ObjectiveType SphericalAberration ChromaticAberration FieldCurvature Achromat 1 Color 546nm 2 Colors 486&656 nm No Plan Achromat 1 Color 2 Colors Yes Fluorite Semi-apochromat 2-3 Colors 2-3 Colors No Plan Fluorite 3-4 Colors 2-4 Colors Yes Plan Apochromat 3-4 Colors 4-5 Colors Yes

16. Résolution latérale et axiale

17. Résolution latérale A. Ouverture numérique, résolution Définition : O.N. = n sin a Tache de diffraction r = 1.22 f l /D Puisque sin a = D/2f, r = 0.61 l /O.N.

18. Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

19. Fonction d’Airy Gaussienne PSF expérimentale

20. Augmenter la résolution : • augmenter l’indice n : objectifs à immersion (eau n=1.33, huile n=1.55) • augmenter a, en construisant des objectifs à focale très courte, que l’on approche très près • Ouverture maximale : N.A. = 1.4, grossissement x100, objectif immersion huile • Pour une longueur d’onde de 500 nm, r = 214 nm. • Limite de séparation de l’œil humain : 100 mm, soit un gain de 500. • Récemment, N.A. = 1.45 (grossissement x60, immersion huile) • Pour la microscopie de fluorescence en onde évanescente : • N.A. = 1.4, n=1.55, a = 64.6° • N.A. = 1.45, n=1.55, a = 69.3° • Réflexion totale interface verre/eau q = 62.5°

21. Objective Type Plan Achromat Plan Fluorite Plan Apochromat Magnification N.A Resolution(µm) N.A Resolution(µm) N.A Resolution(µm) 4x 0.10 2.75 0.13 2.12 0.20 1.375 10x 0.25 1.10 0.30 0.92 0.45 0.61 20x 0.40 0.69 0.50 0.55 0.75 0.37 40x 0.65 0.42 0.75 0.37 0.95 0.29 60x 0.75 0.37 0.85 0.32 0.95 0.29 100x 1.25 0.22 1.30 0.21 1.40 0.20 N.A. = Numerical Aperture

22. B. Profondeur de champ Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la préparation qui donne une image nette. C’est donc l’épaisseur de la tranche d’espace dans laquelle tous les points de l’objet donnent une image nette. Elle dépend de l’ouverture numérique : la profondeur de champ diminue lorsque l’ouverture numérique augmente. Exemples : 25 mm à l’objectif x10 1 mm à l’objectif x100 à immersion

24. Méthodes de contraste optique • fond clair • contraste de phase • contraste interférentiel (aussi appelé Nomarski)

25. Formation des images en fond clair : • Interprétation en termes d’interférences Un objet atténue la lumière le traversant : E = t E0 cos(wt –kz) avec 0<t<1 donc I = t² I0 et l’objet apparaît plus sombre En rouge : E0 En vert : E = tE0 En bleu : -(1-t)E0 Interprétation en termes d’interférences : On peut interpréter cette atténuation comme due à la somme de l’onde incidente non perturbée et d’une onde en opposition de phase (déphasage p) : E = t E0 cos(wt –kz) = E0 cos(wt –kz)- E0 (1-t) cos(wt –kz) E0 cos(wt –kz) + E0 (1-t) cos(wt –kz + p)

26. II. Microscopie à contraste de phase Imagerie d’objets de phase (objets transparents: cellules et microorganismes) Transforme des petits déphasages en variation d’amplitude Échantillons minces non colorés sont transparents en fond clair. Pourtant : suivant structure traversée par la lumière, différence de phase différentes… MAIS l’œil et les détecteurs ne sont sensibles qu’aux changements d’intensité ou de couleur… Pendant longtemps : fixations-colorations abîment les cellules, contraste de phase les respecte

27. Formation des images en contraste de phase : Les objets transparents (cellules et microorganismes, .. ) induisent un déphasage d du champ électrique (en première approximation : pas d’absorption) d = 2p (no-ne) e/l e épaisseur, (no-ne) différence d’indice d faible : ne = 1.36, n0 = 1.335, e =1mm, d = p/10 Après l’objet : E = E0 cos(wt –kz + d) Interprétation en termes d’interférences : E = E0 cos(wt –kz) cos d - E0 sin(wt –kz ) sin d ~ E0 cos(wt –kz) - E0 sin(wt –kz ) sin d L’amplitude ne varie pas… comment transformer cette variation de phase en variation d’amplitude ?

28. Ajouter un déphasage de p/2 (ou –p/2) au champ non perturbé : E = E0 sin(wt –kz)- E0 sin(wt –kz ) sin d = (1-sin d) sin(wt –kz ) E = -E0 sin(wt –kz)- E0 sin(wt –kz ) sin d = -(1+sin d) sin(wt –kz ) Application : observation de cellules vivantes en culture, sans traitement de fixation/coloration

29. En pratique : condenseur à diaphragme annulaire : cône de lumière « directe » qui passe ensuite à travers un objectif à anneau de phase (déphasage p/2 et atténuation de 60 à 90%) Existence d’un halo clair autour des détails sombres, sombre autour des détails clairs… observation des contours gênée et précision des mesures faible Fond noir : contours OK, mais structure interne peu révélée. Passage de l’un à l’autre très utilisé.

31. Microscopie à Contraste Interférentiel Différentiel: Méthode pour détecter des gradients de phase pour les convertir en variations d’intensité Déplacement entre les deux faisceaux inférieur au disque d’Airy

35. Microscopie en fond noir • Les rayons provenant du condenseur • ne pénètrent pas dans l’objectif. • N’apparaissent que les zones qui • diffusent la lumière : • contours des objets opaques • variations brusques d’indice optique • Utilisée surtout pour l’observation • d’objets dont les structures présentent • d’importantes variations d’indice et • qui, faute de contraste, présentent • ne sont pas visibles en fond clair. • Élément d’optique : condenseur avec • diaphragme annulaire : cône de lumière.

36. Microscopie en fond noir • Objets plats à structures régulières (diatomées, radiolaires) • Formations linéaires (flagelles, fibres, bactéries) • Objets punctiformes ou linéaires dont la tailles est < à la limite de séparation • détrôné par contraste de phase (sauf quelques cas)

37. V. Éclairage de Köhler • Plans conjugués dans le chemin d’éclairage: • Filament de la lampe • Diaphragme d’ouverture du condenseur* • Plan focal arrière de l’objectif* • plan du point de l’œil • Plans conjugués dans le chemin de la formation de l’image: • Diaphragme de champ • Plan objet (au foyer) • Plan image intermédiaire • Rétine de l’œil, ou CCD *Plan où des éléments optiques sont insérés dans les divers techniques de microscopie

38. Condenseur : L’éclairage de Köhler permet d’obtenir des images de très bonne qualité Éclairement optimisé: - illumination suffisamment intense de l’objet - uniforme sur le champ de vision

39. Une amibe vue sous différentes techniques (à vous de reconnaître)

40. Microscopie de fluorescence

41. Fluorescence Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons. excitation La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus grande que plus celle d’absorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise → microscopie de fluorescence

42. Microscopie de fluorescence Il s’agit donc d’une détection sur fond noir

43. Système commercial

44. Voir des biomolécules en fluorescence • En général, les molécules biologiques (protéines, acides ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, protéines fluorescentes,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane). • On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents : • couplage covalent (liaison chimique) • marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…) • clonage d’une protéine fluorescente

46. Sources lumineuses

47. Sources lumineuses pour la microscopie de fluorescence

48. Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, nanocristaux

49. Spectres moléculaires : quantification des énergies A. Formation d’une molécule diatomique Molécule stable : il existe un minimum du potentiel d’interaction entre deux atomes B. Niveaux électroniques, vibration et rotation Énergie totale E = Ee + Ev +Er, ces trois énergies sont quantifiées.

50. Niveaux électroniques: • Niveaux électroniques : niveau fondamental, niveaux excités, • transitions entre niveaux (comme dans l’atome d’hydrogène). • Transitions possibles dans le visible ou l’UV (1 à 10 eV) entre deux niveaux • Énergie de vibration : • Fond du puits de potentiel : approximation harmonique • En = hn(n+1/2) avec n2 = k/m • Transitions possibles dans l’IR (0.1 eV) entre deux niveaux. • 3) Énergie de rotation • Spectre de rotation Er = J(J+1) h2/8p2I I : moment d’inertie de la molécule • Transitions possibles dans le domaine m-ondes (0.001 eV) entre deux niveaux