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液相质谱联用仪 (LC-MS/MS) 的应用 —— 以孔雀石绿的检测为例

液相质谱联用仪 (LC-MS/MS) 的应用 —— 以孔雀石绿的检测为例. 中山大学公共卫生学院 曾晓雯 2012.5. 孔雀石绿（ C 23 H 25 ClN 2 ）是一种染料类杀菌剂，渔民用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。. 孔雀石绿有高残留性和致癌、致畸、 致突变等作用； 2002 年 5 月 中国农业部 已将孔雀石绿列入 《 食品动物禁用的兽药及其化合物清单 》 ；

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液相质谱联用仪 (LC-MS/MS) 的应用 —— 以孔雀石绿的检测为例

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  1. 液相质谱联用仪(LC-MS/MS)的应用——以孔雀石绿的检测为例液相质谱联用仪(LC-MS/MS)的应用——以孔雀石绿的检测为例 中山大学公共卫生学院 曾晓雯 2012.5

  2. 孔雀石绿（C23H25ClN2）是一种染料类杀菌剂，渔民用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。孔雀石绿（C23H25ClN2）是一种染料类杀菌剂，渔民用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。

  3. 孔雀石绿有高残留性和致癌、致畸、 致突变等作用； • 2002年5月中国农业部已将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》； • 2005年8月，福建、江西及安徽等地出口的鳗鱼产品，被验出含有孔雀石绿，国家质检总局首次下令全面回收。数日后香港更发现多种淡水鱼含有孔雀石绿，中国因此禁止所有淡水鱼出口到香港。同年9月1日香港在来自台湾的青斑海鱼样本中验出孔雀石绿； • 国标规定（ GB/T19857-2005 ）：1μg/kg

  4. 实验目的 1. 了解高效液相色谱-串联质谱的基本结构； 2. 熟悉LC-MS/MS常用几种检测模式，会（1）应用全扫描模式找孔雀石绿的分子离子峰，（2）应用子离子扫描模式找孔雀石绿的二级特征碎片离子，并（3）应用多重反应监测（MRM）测定样品孔雀石绿的含量。

  5. Interface (Key to Success!) HPLC MS 液相(HPLC)到质谱(MS)的接口 • 液相(HPLC) • 高效分离混合物 • 出口压力为大气压 • 可以使用缓冲盐溶液 质谱分析仪(MS) • 需要高真空条件 • 质量分析系统 • 最好使用挥发性缓冲液

  6. 真空系统 质量分析器 离子源 检测器

  7. + 溶剂蒸发 + + - - + + + + + + + + + + - - + - - + + + - - + - + + + + + + + - - - + + - + + + - + + + 离子源：电喷雾(ESI)的电离过程 带电液滴 溶剂离子束 Rayleigh Limit Reached 分析物离子 + 库仑爆炸 （Coulomb Explosions）

  8. 液质联用的电喷雾(ESI)接口 高能打拿极/电子倍增器 液相的入口 锥孔 透镜 雾化气入口 四极杆 八极杆 毛细管 雾化器 + + Neutral Molecules Analyte Ions Clusters Salts + + + + + + + + + + + + + + + + 加热N2

  9. ESI电离原理 正离子模式 负离子模式

  10. 质量分析器 • 质量分析器：是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

  11. + + + + • 四级杆：在两个相对的极杆之间加电压(U+Vcost)，在另两个相对的极杆上加-(U+Vcost)。离子进入可变电场后，只有具合适的曲率半径的离子可以通过中心小孔到达检测器。

  12. 实验室现有的质量分析器类型 串联四极质谱仪(MS/MS)：三重四极（QqQ） 离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器 MS1 CID MS2 Q1 q2 Q3 • 选择一定质荷比的离子通过一级质谱(MS1)，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体进行碰撞诱导裂解(collision—induced dissociation，CID)，发生离子一分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2)进行分析

  13. 三重四级杆QQQ • 全扫描(Full Scan) • 子离子扫描(Product ion Scan) • 多反应监测(MRM)

  14. （1）全扫描 • 全扫描用于检测离子源产生的离子流中，各种离子的m/z和强度。从全扫描得到的信息可以知道目前样品中的组分状态； • 全扫描模式下三重四极杆只有一把四极杆发挥了功能。这种模式仅仅是为了对样品有个初步的了解。挑选需要进一步分析的离子 。

  15. （2）子离子扫描 (product ion scan) MS1 CollisionCell MS2 • 这时Q1工作在SIM模式，即只允许母离子这一种m/z的离子通过； • Q2碰撞室工作在碰撞碎裂模式（CID）； • Q3在做全扫描，检测Q2产生的子离子碎片m/z和强度。 • 用MS2质量分析器扫描指定母离子的子离子碎片，所得到的质谱图只能是由指定母离子经碰撞产生。

  16. 子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信息，区别几种m/z相同的母离子，降低假阳性率。子离子扫描可以得到母离子的碎片信息。这些信息可以帮助操作者了解母离子的结构信息，区别几种m/z相同的母离子，降低假阳性率。

  17. (3) 多重反应监测 多重反应监测(MRM)是三重四极杆最强大的功能 • 一种母离子变成碎片就包含了多个反应： 化学反应：A a+b+c通过Q1选择A，Q2碎裂A变为a、b、c，Q3测量a或b或c的强度，就可以知道A a+b+c这一化学反应的强度，间接知道反应物A的强度，据此可以对A进行定量

  18. MS1 CollisionCell MS2 • 指定的母离子产生一指定的子离子，两个质量分析器都是静态的; • 由于通过Q1和Q2两重选择，可以限定母离子m/z和子离子m/z两个参数。母离子和子离子m/z相同的情况，大多属于具有同分异构体关系的样品，出现的概率较低，所以MRM的选择性极高。

  19. LC-MS/MS(安捷伦,6410)的基本操作

  20. 1. 仪器使用一段时间后需要调谐

  21. 2. 建立方法 • （1）双击桌面MassHunter 数据采集图标，进入MassHunter数据采集界面。 • 在这个界面中完成所有的方法编辑，这里有HPLC 和QQQ各参数项的弹出菜单。

  22. （2）点击自动进样器菜单，设定进样量，设置自动进样器的参数。建议设置带洗针的进样，这样可以显著减少样品交叉污染。（2）点击自动进样器菜单，设定进样量，设置自动进样器的参数。建议设置带洗针的进样，这样可以显著减少样品交叉污染。 • （3）输入泵的流量、流动相比例。 • （4）在柱温箱编辑画面输入柱温箱温度。 • （5）在MS QQQ 参数画面， 注意为方法选合适的调谐文件， 缺省的调谐文件为Atune.TUNE.XML

  23. 安捷伦LC-MS/MS质谱参数的设定 • Time Segments ：如果你有多种化合物需要分析，可以根据保留时间的不同，分成若干个时间段，每个时间段内只对相应的几种化合物进行采集，有助于提高一起灵敏度。 • MS1 Res、MS2 Res：质谱1和质谱2的分辨率，设为Unit。 • Fragmentor：裂解电压，对于离子源内CID和离子传输起作用。优化fragmentor，保证母离子的最大传输效率，即尽可能多到达碰撞池。通常分子量越大、裂解电压需要越高。 • Collision Energy：碰撞能量，二级质谱CID所需离子的加速电压，通常在50V一下。 • Dwell：驻留时间，四极杆一次采集特定的离子的时间。

  24. 在方法编辑界面中可设置QQQ 的离子源参数：Gas Temp., Gas Flow, Nebulizer, Capillary etc.

  25. 3. 提取色谱图 • （1）双击桌面Agilent Masshunter Qualitative Analysis 图标，然打开数据文件； • （2）在打开的谱图上单击右键，选择Extract Ion Chromatogram，然后在Type 处选择，在m/z Values(s):处输入要提取的质量数或范围，选择OK 即可。

  26. （3）要对谱图进行积分，选择Integrate(MS)等。然后选择执行（3）要对谱图进行积分，选择Integrate(MS)等。然后选择执行 绿色箭头进行积分。面积列表可以点击积分列表来观看。

  27. 实验原理 • 利用液质联用LC-MS/MS的ESI离子源的正离子模式检测样品孔雀石绿的含量; • 孔雀石绿含有氨基,容易得到H+而形成较为稳定的[M+H]+准分子离子,因此选择ESI正离子电离模式。

  28. 孔雀石绿的测定 • 孔雀石绿分子量364.9

  29. 孔雀石绿的测定 • （1）全扫描模式，找出孔雀石绿的分子离子m/z，即一级质谱的母离子。

  30. 孔雀石绿的测定 • （2）子离子扫描模式，找出孔雀石绿的特征碎片离子；灵敏度最高的碎片离子可以作为MRM模式的定量离子，次级灵敏的碎片离子可以作为辅助定性离子

  31. 孔雀石绿的测定 • （3）利用前面扫描模式找到的母离子和子离子，用MRM扫描模式做标准样品，记录积分峰面积作标准曲线图，计算2个样品中孔雀石绿的含量。 MRM模式

  32. 实验报告 • 简述几种常用扫描模式的基本原理； • 记录孔雀石绿的母离子、特征子离子及其对应扫描模式参数的设定； • 用MRM模式，定量样品中孔雀石绿的含量

  33. 思考题 • 液质联用仪器的应用

  34. 5月21日周一中午把作业交到公卫学院919，谢 谢

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