Developmental Genetics

1. Developmental Genetics

2. Developmental Genetics Topics : I. Genetic Basis of Differentiation II. Control of Gene Expression in Differentiation III. Nature of Determination

3. Development ของ organism • การเจริญพัฒนา Single fertilized egg cell เป็น embryo และไปเป็น adult • Adult ประกอบด้วย cells จำนวนหลาย trillions (1012) ซึ่งถูกจัดเป็นองค์กรได้ organs ต่าง ๆ • Organ ประกอบด้วย tissues กลุ่มต่าง ๆ ที่มีหน้าที่และความชำนาญต่างกัน • Tissue คือ กลุ่มเซลล์ที่มีรูปร่างและ หน้าที่คล้ายกัน

4. Cell Differentiation

5. Embryonic development ของ Amphioxus

6. Differentiation • การแสดงออกของ คุณลักษณะพิเศษ (specialized characteristics) ของเซลล์ type ต่าง ๆ • Specialized cellular functions ขึ้นกับ 1) Proteins : structural proteins for cell shapes 2) Enzymes : specific chemical reactions 3) Hormones : signals from cell to cell

7. Genetics ของ Developmental Pathway • วิเคราะห์ ด้วย Mutation • Developmental pathway ประกอบด้วยเหตุการณ์ใน differentiation • ทำให้เกิดโครงสร้างของ tissues และ organs หรือก็คือ Phenotypes ของ differentiated cells

8. ส่วนประกอบของ Developmental pathway • Different gene products • Signal molecules : signal receptors • Cytoplasmic proteins : signal transducers • Transcription factors • Regulator proteins

9. I. Genetic Basis of Differentiation

10. I. Genetic Basis of Differentiation 1. Theory of development 1.1 Theory of Mosaic Development 1.2 Theory of Regulative Development 2. Substances of development 2.1 Determinants 2.2 Inducers 2.3 Morphogens

11. Genetic Basis ของ Cell Differentiation • Early embryonic cells: จำนวนมากเหมือนกันทั้ง รูปร่างและหน้าที่ • Differentiated cells : ผลิต specialized products 2 กลุ่มใหญ่ 1) Fundamental proteins ที่จำเป็น (vital) ต่อชีวิตโดย Housekeeping genes : RNA polymerases & ribosomal proteins 2) Specialized cell products สำหรับบาง organs โดย Luxury genes : hemoglobin, insulin

12. Theory of Development

13. 1. Theory of Development มี 2 ทฤษฏี อธิบายให้รู้ว่า Expression ของ genes ระหว่าง development ในเซลล์แต่ละชนิดไม่เหมือนกัน • gene หนึ่ง express ในเซลล์ชนิดหนึ่ง • gene อื่น express ในเซลล์อีกชนิดอื่น 1.1 Theory of Mosaic Development 1.2 Theory of Regulative Development

14. 1.1 Theory of Mosaic Development • Differentiation ของ embryonic cells เกิดจากการสูญเสีย genetic potential ตั้งแต่เริ่มต้นไปเรื่อย ๆ ระหว่างการเปลี่ยนแปลง • ในแต่ละ cell cycle ระหว่าง development เซลล์ลูกจะไม่ได้ genetic material เท่ากัน --> เซลล์ไม่เหมือนกัน • เมื่อรวมเซลล์ทั้งหมดใน organism จึงมีเซลล์หลายแบบคละกันเป็นกระ (mosaic) • Embryo เรียกว่า Mosaic embryo

15. นั่นคือ ระหว่างแบ่งเซลล์ Genes ถูกแบ่งเป็นส่วน • genes ส่วนมากสูญเสีย potential ระหว่าง differentiation คง เหลือแต่ 1. Housekeeping genes และ 2. Luxury genes • ใน invertebrate พบความแตกต่างของเซลล์ใน embryo ตั้งแต่ระยะ 2 เซลล์ ขึ้นไป และ • พบว่าถูก programmed มาแล้ว เช่นส่วนที่ differentiate ไปเป็น ระบบประสาท หรือ กล้ามเนื้อ

16. 1.2 Theory of Regulative Development • เซลล์ embryo ของ eukaryote ชั้นสูงติดอยู่รวมกันจนถึงระยะ 8 cells จึงแยกกันเป็นแต่ละเซลล์ • ทั้ง 8 เซลล์สามารถ develop เป็น 8 organisms • แสดงว่าแต่ละเซลล์ของทั้ง 8 ถูกควบคุม (regulated) ให้มีคุณสมบัติ Totipotent คือ ยังคงมี genetic materials ครบทั้งหมดสามารถแยกให้เจริญเป็น 8 ตัวปกติได้ • Embryo เรียกว่า Regulative embryo

17. นั่นคือ เซลล์ embryo รักษา genetic materials ไม่ให้สูญเสีย เป็นเวลานานถึง 3 cell division cycles ซึ่งเป็นเวลานานกว่า mosaic development • พัฒนาการแบบนี้ เรียกว่า Regulative development เช่น embryo ของ humans ที่เกิดแฝดเหมือนได้หลายคน (ถึง 8 คน)

18. ผ่านระยะนี้แล้ว totipotency ไม่แน่นอน อาจ • คง totipotent เช่น stem cells/ precursor cells ของ เซลล์เม็ดเลือดในใขกระดูก • สูญเสีย genetic potential ส่วนมากไป เช่น muscle cells และ nerve cells ในพืช adult cell เพียง 1 เชลล์ เป็น totipotent differentiated cells สามารถเจริญเป็นพืชทั้งต้นได้ ซึ่งใช้ประโยชน์ในการทำ tissue culture

19. โดยสรุป : animals & plants • บางชนิดมี totipotent differentiated cells บางชนิดไม่มี • ดังนั้นการสูญเสีย genetic material ใน differentiation ของเซลล์ จึงไม่จำเป็น และ • ไม่มีหลักฐานการสูญเสีย genes ระหว่าง cell differentiation • แต่มีหลักฐานแสดงว่า cell differentiation มีสาเหตุจาก Epigenetic changesซึ่งเป็นการเปลี่ยนใน gene expression ไม่ใช่ที่ตัว genes โดยตรง

20. Substances in Development

21. 2. 1 Determinant • ก่อนเซลล์ differentiate และ express specific function เซลล์ต้องผ่านกระบวนการ Determination • Determination เป็นระยะที่เซลล์ผ่าน point of no return หรือ irreversible commitment ใน Development program หรือ fate หรือตัดสินชนิดของเซลล์ • พบว่ามี สาร Effector substancesใน cytoplasm ในใข่ เป็น Determinants

22. Gradient of determinationsdeterminants อยู่ใน egg และกระจายไม่เท่ากันกระจายจากมากไปหาน้อยเป็นระดับ (gradient) จาก บน --> ล่าง (animal pole --> vegetal pole) และจาก side --> side

23. Determinants อาจเป็น Maternal messages • mRNA สังเคราะห์ขึ้นจำนวนมากแล้วเก็บสะสมไว้ระหว่าง การเจริญของ egg (developing egg) หรือ • Determinants อาจเป็น Transcription factors ซึ่งจะไม่พบใน egg • แต่สังเคราะห์โดย embryonic cells ของ embryo ในระยะหลัง

24. 2.2 Inducers • Substance ที่เซลล์หนึ่งผลิตขึ้นให้ไปมีอิทธิพลต่อ การพัฒนาการของอีกเซลล์หนึ่ง หรือ เป็น Signal จาก cell ถึง cell เช่น • เนื้อเยื่อ embryo 3 ชั้น Mesoderm จะ induce development ของ Ectoderm • กล้ามเนื้อ induce พัฒนาการของ ระบบประสาท

25. 2.3 Morphogens • เป็น subsets ของ determinant และ inducer • Morphogen ตัดสินรูปร่าง (morphology) ของ embryo ที่กำลังพัฒนา • Morphogen สามารถชักนำให้เกิดการเปลี่ยนรูปร่างในต่าง embryo ได้ในการทำ transplantation • เช่น ใน chick limb bud มี Retinoic acid กำหนดและชักนำให้พัฒนา เป็นนิ้ว (digits)

26. พบว่า Retinoic acid เป็น morphogen ในพัฒนาการของหลายเนื้อเยื่อและหลายสิ่งมีชีวิตรวมทั้งคน • Retinoic acid ยังสามารถทำงานร่วมกับ hormones อื่นใน differentiation ได้ด้วย

27. II. Control of Gene Expressionin Differentiation

28. II. Control of Gene Expression in Differentiation • Differentiation เกิดโดยการ turn-on ของ genes ที่เลือกแล้ว • เป็น control ของ structural gene expression ระดับ • Transcription, • Posttranscription, • Translation และ • Posttranslation

29. Control ใน Prokaryote • มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากใน gene expression และ cellular activity • เช่น ใน bacteria เจริญจาก Sporulation --> Vegetative • พบการเปลี่ยนที่ sigma (s) factor ของ RNA polymerase และ เปลี่ยนตามเวลา

30. Control ใน Eukaryote Expression ของ luxury genes 1. Hormone activation of genes 2. Hormone-responsive elements 3. Light-induction of plant genes

31. 1. Hormone Activation on Genes • Hormone ทำงานโดย turn on transcription ของ specific genes ใน target cells ได้ 1. โดยตรง โดย เข้าไปจับกับ genes ใน nucleus 2. โดยอ้อม โดยผ่าน second messenger ที่ cell membrane หรือใน cytoplasm • Hormone action เป็น complex process ทั้ง 2 วิธี ต้องมี receptor เฉพาะชนิด hormone

32. Steroid Hormone • Steroid hormone มีบทบาทสำคัญใน development และ differentiation • Steroid hormone ซึมผ่าน cell membrane เข้า cytoplasm เข้า nucleus ไปจับกับ receptor ใน nucleus • Hormone-receptor complex ไปจับ chromatin ไป activate genes ที่เกี่ยวข้องให้มี Transcription

33. Effect ของ Steroid Hormone ต่อ Gene Expression

34. Activation ของ Estrogen ต่อ Ovalbumin Gene ใน chick oviduct • estrogen-receptor complex มี binding site ที่ระหว่าง 250-300 base pairs upstream จาก TATA box • hormone-receptor complex ก็คือ transcription factor ที่ bind และ stimulate ที่ตำแหน่ง enhancer ของ gene

35. Hormone อีกหลาย family ที่มี receptor ใน nucleus ซึ่งมีบทบาทสำคัญใน development 1) Glucocorticoid receptor : mediate gene โดย hormone cortisol 2) Vitamin D3 receptor 3) Thyroid hormone receptor 4) Retinoic acid receptor • Response ของเซลล์ ขึ้นกับการมี receptor หรือไม่

36. 2. Hormone-Responsive Elements (HRE) • คือ Enhancer สำหรับจับกับ receptor ของ hormone หรือกับ hormone-receptor complex • Enhancer ที่ถูกจับแล้วจึงไปช่วย Promotor ของ gene เพื่อให้ RNA polymerase ทำ transcription บน gene ได้ • พบมี HRE สำหรับ hormone และ receptor หลายชนิด

37. 2.1 HRE สำหรับ Retinoic Acid Receptor Retinoic acid responsive element (RARE) เป็น binding site บน DNA สำหรับจับ Retinoic acid receptor (RAR) RAR โมเลกุลคล้ายนิ้วมือ เรียกว่าFinger protein ซึ่งมี 2 Zinc fingers

38. Retinoic acid receptor (RAR) = protein • จับกับ Retinoic acid responsive element (RARE) = DNA sequence ได้ RAR-RARE complex บน DNA • แล้ว Retinoic acid (R) จึงเข้าจับกับ RAR-RARE complex • RAR-RARE complex จึงไป stimulate gene ที่อยู่ใกล้ • RARE พบใน growth hormone geneในต่อม pituitary ซึ่งผลิต growth hormone

39. Action ของ Retinoic Acid RAR (receptor) + RARE (element) RAR-RARE Complex /----Promotor-----Gene-----/ /-------RAR-RARE-Promotor-----Gene-----/ Transcription Retinoic Acid RNA Polymerase

41. 2.2 HRE สำหรับ Thyroid hormone receptor (THR) • RARE เป็น enhancer ของ Thyroid hormone receptor (THR) ด้วย • ทำให้ thyroid hormone ทำงานร่วมกับ retinoic acid ในการ ควบคุมการผลิต growth hormone • โดย thyroid hormone receptor จับกับ RAR ได้ dimer ไปจับ growth hormone RARE --> turn on growth hormone gene --> growth hormone

42. 2.3 RARE เป็น Enhancer ของ Vitamin D3 Receptor • Vitamin D3ทำงานร่วมกับ Retinoic acid • โดยจับกับ VDR และ RAR ตามลำดับ ที่ RARE • ร่วมกัน turn on Osteocalcin gene --> product เกี่ยวกับ differentiation ของ immature Osteoblasts • Osteoblasts uptake calcium • Osteoblasts differentiate เป็น mature Osteocytes

43. สรุปได้ว่า Cells ทั้งหมด response ต่อ hormoneไม่เหมือนกัน เพราะ มี • hormone receptor มีความเฉพาะ specificity ต่างกัน • Hormones ส่วนมากมี target เพียง 2-3 cell types • กรณี Retinoic acid ใน vertebrate มี receptor 3 types • เฉพาะ typeRARaพบมีในเซลล์เกือบทุกชนิด • Retinoic acid จึงเป็น Morphogen พื้นฐาน • Hormone receptor เองเป็น protein ก็เป็นผลของ differentiation ด้วยเช่นกัน

44. 3. Light-induction of plant genes • ต้นกล้า (Seedling) ของพืชเจริญในความมืด จะไม่สร้าง photosynthetic apparatus ซึ่งคือ chlorophyll เพื่อประหยัดพลังงาน • เมื่อได้รับแสง seedling จึงเปลี่ยนเป็นสีเขียว โดย enzyme สร้าง chlorophyll เป็น light-activated enzyme ชื่อ Ribose biphosphate carboxylase หรือ Rubisco

45. Rubisco Gene ลักษณะของ Rubisco gene และ light-inducible genes • Promoter : • ที่ -35 base pair region มี TATA box • Sequence จาก -35 ถึง -46 เป็น light dependent และ • จากตำแหน่ง-46 upstream จึงตอบสนองต่อแสง • Enhancer : • Region จาก -327 ถึง -48 ช่วย stimulate rubisco gene ในการตอบสนองต่อแสง

46. Promoter & enhancer ของ Light response gene (a) Rubisco gene จาก pea cloned ใส่ petunia cells (b) Rubisco gene จาก pea cloned ใส่ tobacco

47. Control Expression ของ gene ใน cell differentiation ใน plants และ animals Regulatory region / 5’-flanking region แบบ • cis-acting DNA คือ Control region อยู่บนสายเดียวกับ structural gene เช่น TATA box และ GC box • trans-acting protein เช่น transcription factor จับบน DNA สายตรงข้ามกับ template

48. III. Nature of Determination

49. Determination • คือ กระบวนการตัดสินที่ไม่ย้อนกลับ เพื่อให้ cell ดำเนินไปตาม developmental pathway • เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนสภาวะทางกายภาพของ Chromatin โดย factor ป้องกัน histones ไปจับที่ control regions ของ genes

50. วิธี Determination • 1. DNase Hypersensitivity • 2. Control expression ของ 5S rRNA • 3. DNA methylation