Developmental Genetics

1. Developmental Genetics

2. Development Single fertilized egg cell พัฒนาเป็น embryo เป็น adult ที่ประกอบด้วย cells จำนวนหลาย trillions ซึ่งจัดองค์กรได้เป็น organs ต่าง ๆ และแต่ละ organ มีหน้าที่และความชำนาญต่างกัน

3. Development of Amphioxus

4. Embryoระยะ Blastula Fate map ด้านขวาของ blastiderm ของแมลงหวี่

5. Differentiation การแสดงออกของ คุณลักษณะพิเศษ (specialized characteristics) ของเซลล์ type ต่าง ๆ Specialized cellular functions ขึ้นกับ 1) Proteins : structural proteins for cell shapes 2) Enzymes : specific chemical reactions 3) Hormones : signals from cell to cell

6. Topics I. Genetic Basis of Differentiation II. Control of Gene Expression in Differentiation III. Nature of Determination IV. Gene rearrangement during development

7. I. Genetic Basis of Differentiation 1. Theory of development 1.1 Mosaic Development 1.2 Regulative Development 2. Substances of development 2.1 Determinats 2.2 Inducers 2.3 Morphogens

8. Genetic Basis ของ Cell Differentiation Early embryonic cells : จำนวนมากเหมือนกันทั้ง รูปร่างและ หน้าที่ Differentiated cells : ผลิต specialized products 1) Fundamental proteins ที่จำเป็น (vital) ต่อชีวิต โดยHousekeeping genes : RNA polymerase & ribosomal proteins 2) Specialized cell products สำหรับบาง organs โดยLuxury genes :hemoglobin, insulin,

9. Different specialized cells ทำให้เกิด different specialized proteins. Specialized proteins ตัดสินว่า cells สามารถทำอะไรได้ Cell differentiation เป็นการสะท้อนถึง differential gene activity.

10. Genetic basis of cell differentiation (ต่อ) 1. Theory of Development

11. Theory เพื่อตอบคำถามว่า อะไรทำให้ gene หนึ่ง express ใน เซลล์ชนิดหนึ่ง และ gene อื่น express ในเซลล์อีกชนิดหนึ่ง Theory ของ Development มี 2 theories 1. Mosaic Development 2. Regulative Development

12. Mosaic development differentiation ของ embryonic cells เกิดจากการ สูญเสีย genetic potential ตั้งแต่เริ่มต้นไปเรื่อย ๆ ระหว่างการเปลี่ยนแปลง ในแต่ละ cell cycle ระหว่าง development เซลล์ ลูกจะไม่ได้ genetic material เท่ากันและเซลล์ไม่เหมือนกัน เมื่อรวมเซลล์ทั้งหมดจึงคล้าย mosaic เรียกว่า Mosaic embryo

13. นั่นคือ ระหว่าง cell division genes ถูกแบ่งเป็นส่วน (partition) และ genes ส่วนมากสูญเสีย potential ระหว่าง differentiation คงเหลือแต่ 1. Housekeeping genes และ 2. Luxury genes สำหรับ specialized functions ทำให้ cells มีความแตกต่างกัน

14. ใน invertebrate พบความแตกต่างของเซลล์ใน embryo ตั้งแต่ระยะ 2 เซลล์ ขึ้นไป และพบว่าถูก programmed มาแล้ว เช่นส่วนที่ differentiate ไปเป็น ระบบประสาท หรือ กล้ามเนื้อ

15. Regulative development เซลล์ embryo ของ eukaryote ชั้นสูงติดอยู่รวมกันจนถึงระยะ 8 cells จึงแยกกันเป็นแต่ละเซลล์ ทั้ง 8 เซลล์สามารถ develop เป็น 8 organisms แสดงว่าแต่ละเซลล์ เป็น Totipotent คือสามารถเจริญหรือผลิตให้เป็น organism ทั้งตัวได้ปกติ

16. Embryo เรียกว่า Regulative embryo นั่นคือ เซลล์ embryo รักษา genetic materialไม่ให้สูญเสีย เป็นเวลานานถึง 3 cell division cycles ซึ่งเป็นเวลานานกว่า mosaic development พัฒนาการแบบนี้ เรียกว่า Regulative development เช่น embyro ของ humans ที่เกิดแฝดเหมือนได้หลายคน (ถึง 8 คน)

17. ผ่านระยะนี้แล้ว totipotency ไม่แน่นอน อาจ คง totipotent เช่น stem cells/ precursor cells ของ เซลล์เม็ดเลือดในใขกระดูก ในพืช adult cell เพียง 1 เชลล์ เป็น totipotentdifferentiated cellsสามารถเจริญเป็นพืชทั้งต้นได้ ซึ่งใช้ประโยชน์ในการทำ tissue culture สูญเสีย genetic potential ส่วนมากไป เช่น muscle cells และ nerve cells

18. โดยสรุป : animals & plants บางชนิดมี totipotent differentiated cells บางชนิดไม่มี ดังนั้นการสูญเสีย genetic material ใน differentiation ของเซลล์จึงไม่จำเป็น และไม่มีหลักฐานการ สูญเสีย genes ระหว่าง cell differentiation แต่มีหลักฐานแสดงว่า cell differentiation มีสาเหตุ จาก Epigenetic changesซึ่งเป็นการเปลี่ยนใน gene expression ไม่ใช่ที่ตัว genes โดยตรง

19. Genetic basis of cell differentiation (ต่อ) 2. Substances in Development

20. 2. 1 Determinant ก่อนเซลล์ differentiate และ express specific function เซลล์ต้องผ่านกระบวนการ Determination Determinationเป็นระยะที่เซลล์ผ่าน point of no return หรือ irreversible commitment ใน Development program หรือ fate หรือตัดสินชนิดของเซลล์

21. พบว่ามี สาร Effector substancesใน cytoplasm ในใข่เป็น Determinants determinants อยู่ใน egg และกระจายไม่เท่ากัน แต่กระจายจากมากไปหาน้อยเป็นระดับ (gradient) จาก บน --> ล่าง (animal pole --> vegetal pole) และจาก side --> side

22. Gradient of determinations

23. determinants อาจเป็น Maternal messages ที่ mRNA สังเคราะห์ขึ้นจำนวนมากแล้วเก็บสะสมไว้ระหว่าง การเจริญของ egg (developing egg) หรือ determinantsอาจเป็น Transcription factors ซึ่งจะไม่พบใน egg แต่สังเคราะห์โดย embryonic cells ของ embryo ในระยะหลัง

24. 2.2 Inducers Substance ที่เซลล์หนึ่งขึ้นให้ไปมีอิทธิพลต่อ การพัฒนาของอีกเซลล์หนึ่ง หรือเป็น signal จาก cell to cell เช่น เนื้อเยื่อ embryo 3 ชั้น Mesoderm จะ induce development ของ Ectoderm กล้ามเนื้อ induce พัฒนาการของ ระบบประสาท

25. 2.3 Morphogens เป็น subsets ของ determinant และ inducer morphogen ตัดสินรูปร่าง (morphology) ของ developing embryo ใน vertebrates morphogen สามารถชักนำให้เกิดการเปลี่ยน รูปร่างในต่าง embryo ได้ในการทำ transplantation เช่น ใน chick limb bud มี Retinoic acid กำหนดและชักนำให้พัฒนาเป็น digits

26. พบว่าRetinoic acid เป็น morphogenในพัฒนาการของหลายเนื้อเยื่อและหลายสิ่งมีชีวิตรวมทั้งคน Retinoic acid ยังสามารถทำงานร่วมกับ hormones อื่นใน differentiation ได้ด้วย

27. II. Control of Gene Expressionin Differentiation

28. Differentiation เกิดโดยการ turn-on ของ genes ที่เลือกแล้วได้อย่างไร เป็น control ของ structural gene expression ระดับ Transcription, posttranscription, translation และ posttranslation

29. Control ใน Prokaryote มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากใน gene expression และ cellular activity เช่น ใน bacteriaSporulation --> Vegetative เปลี่ยนที่ sigma factor ของ RNA polymerase และ เป็น time-dependent shift

30. Control ใน Eukaryote Expression ของ luxury genes 1. Hormone activation of genes 2. Hormone-responsive elements 3. Light-induction of plant genes

31. 1. Hormone activation of genes Hormone ทำงานโดย turn on transcription ของ specific genes ใน target cells ได้ 1. โดยตรง โดย เข้าไปจับกับ gene ใน nucleus 2. โดยอ้อม โดยผ่าน second messenger ที่ cell membrane/cytoplasm Hormone action เป็น complex process ทั้ง 2 วิธี ต้องมี receptor เฉพาะชนิด hormone

32. ใน development และ differrentiation พบว่า steroid hormone แสดงบทบาทสำคัญ Steroid hormone ซึมผ่าน cell membrane เข้า cytoplasm เข้า nucleus ไปจับกับ receptor ได้เป็น hormone-receptor complex แล้วไปจับ chromatin ไป activate corresponding genes ให้มี transcription

33. Steroid hormone action

34. hormone-receptor complex ก็คือ transcription factor ที่ bind และ stimulate ที่ตำแหน่ง enhancerของ gene Activation ของ estrogen ต่อ ovalbumin gene ใน chick oviduct พบว่า estrogen-receptor complex มี binding site ที่ระหว่าง 250-300 base pairs upstream จาก TATA box

35. มี hormone อีกหลาย family ที่มี receptor ใน nucleus เช่น 1) glucocorticoid receptor : mediate gene โดย hormone cortisol 2) vitamin D3 receptor มีบทบาท 3) thyroid hormone receptor สำคัญใน 4) retinoic acid receptor developnemt response ของเซลล์ ขึ้นกับการมี receptor หรือไม่

36. 2. Hormone-responsive elements Hormone-responsive element (HRE) หรือ site บน DNA ซึ่งก็คือ Enhancerสำหรับให้ hormone-receptor complex จับ พบว่า 1. Retinoic acid responsive element (RARE) binding site บน DNA สำหรับ Retinoic acid receptor (RAR)

37. RAR เป็น Finger protein ที่มี 2 Zinc fingers RAR จับกับ RARE ได้ RAR-RARE complex แล้วretinoic acid จึงจับกับ complex ที่หลัง จากนั้น complex ทั้งหมดจึงไป stimulate gene ที่อยู่ใกล้ RARE พบใน growth hormone gene ใน pituitary ซึ่งผลิด growth hormone ก่อนและหลังเกิด

38. RAR-RARE interaction Zinc finger protein

39. Transcription factors ใน Development Helix-turn-helix Copper fist Leucine zipper

40. 2. RARE เป็น enhancer ของ Thyroid hormone receptor (THR) ด้วย ทำให้ thyroid hormone ทำงานร่วมกับ retinoic acid ในการควบคุม growth hormone โดย thyroid hormone receptor จับกับ RAR ได้ dimer ไปจับ growth hormone RARE --> turn on growth hormone gene --> growth hormone

41. 3. RARE เป็น enhancer ของ Vitamin D3 Vitamin D3 ทำงานร่วมกับ retinoic acid โดยจับกับ VDR และ RAR ตามลำดับ เพื่อร่วมกัน turn on Osteocalcin gene ให้ product เกี่ยวกับ differentiation ของ immature osteoblast (เซลล์กระดูก) ให้ uptake calcium ทำให้ cellmature

42. Cells ทั้งหมด response ต่อ hormoneไม่เหมือนกัน เพราะ มี specific hormone receptor ไม่เหมือนกัน Hormones ส่วนมากมี target เพียง 2-3 cell types กรณีของ retinoic acid ใน vertebrate มี receptor 3 types โดยเฉพาะ typeRARaพบมีในเซลล์เกือบทุกชนิด Retinoic acid จึงเป็น Morphogen พื้นฐาน Hormone receptor เองเป็น protein ก็เป็นผลของ differentiation ด้วย

43. 3. Light-induction of plant genes Seedling ของพืชเจริญในความมืด จะไม่สร้าง photosynthetic apparatus ซึ่งคือ chlorophyll เป็นการประหยัดพลังงาน จนเมื่อได้รับแสง seedling จึงเปลี่ยนเป็นสีเขียว enzyme สร้าง chlorophyll เป็น light-activated enzyme ชื่อ Ribose biphosphate carboxylase หรือ Rubisco

44. Rubiscao gene และ light-inducible genes อื่น ๆ Promoter : sequence จาก -35 ถึง -46 เป็น light dependent และ ที่ -35 base pair region มี TATA box จากตำแหน่ง-46 upstream response ต่อแสง Enhancer : region จาก -327 ถึง -48 ช่วย stimulate rubisco gene response ต่อแสง

45. Light activation of plant gene

46. Control Expression ของ gene ใน cell differentiation ใน plants และ animals มี regulatory region / 5’-flanking region แบบ cis-acting DNA คือ control region อยู่บนสายเดียวกับ structural gene เช่น TATA box และ GC box และ มี trans-acting protein เช่น transcription factor

47. III. Nature of Determination

48. Determination คือ process ที่ cells make irreversible decision เพื่อให้ cell ดำเนินไปตาม developmental pathway ซึ่งจะเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนสภาวะทางกายภาพของ Chromatin โดย factor ที่ป้องกัน histones ไม่ให้ไปจับที่ control regions ของ genes

49. 1. DNase Hypersensitivity บางแห่งบน active chromatin ไวต่อการย่อยด้วย DNase I เรียกว่า DNase hypersensitive site ซึ่ง เป็น site ที่ไม่มี Nucleosome เป็นช่วง sequence ประมาณ 300 bp ระหว่าง 2 nucleosomes (nucleosome คือ chromosomal protein หรือ Histones ที่จับอยู่กับ DNA ให้เป็น chromatin / chromosome)

50. พบว่า DNase hypersensitive region ก็คือ 5’- flanking region / regulatory region (promoter & enhancer) ที่ transcribed ด้วย RNA Pol II Hypersensitive region ทำหน้าที่ turn on/off gene โดยต้องมี factor (protein) ป้องกันไม่ให้บริเวณ hypersensitivity นี้มีการสร้าง Nucleosome