Valorizzazione dei prodotti agroalimentari di qualità

1. Valorizzazione dei prodotti agroalimentari di qualità Qualità e Sicurezza Chimica. Concetti di base e tecniche analitiche La chimica analitica ed il suo impatto sul comparto alimentare Dr. Manuel Sergi msergi@unite.it

2. Ricerca e Food Safety • Gli sforzi congiunti di tossicologi, epidemiologi, chimici (che da una parte creano il rischio e dall’altra cercano di porvi rimedio...) hanno portato negli anni ad una migliore comprensione dei fenomeni tossici • La limitazione del rischio correlato con sostanze tossiche avviene attraverso: • Strumenti legislativi • Tecniche analitiche

3. Tipologie Strumentali • Nel controllo di processi (industriali) lo sviluppo tecnologico e la ricerca applicata è maggiormente centrata sui sensori (varie tipologie) • Per il controllo di sostanze nocive ai sensori vengono affiancate anche tecniche strumentali più complesse, che consentono di ottenere maggiori informazioni quali-quantitative, con la possibilità di valutare quantità molto piccole • Questa caratteristica è molto importante in quanto alcune sostanze hanno una tossicità elevata già a bassissime concentrazioni (pesticidi, endocrines disruptor...)

4. SICUREZZA ALIMENTARE

8. Gli Ormoni • Vengono secreti dalle ghiandole degli animali superiori • Regolano lo sviluppo, la crescita, la riproduzione, il comportamento • Molecole naturali e sintetiche vengono usate in campo zootecnico per incrementare le rese produttive

9. Meccanismo di Azione • Agiscono su specifici recettori situati nel citoplasma delle cellule bersaglio per dare effetti: • Anabolizzanti • Progestinici • Estrogeni

10. Effetto Anabolico STIMOLAZIONE DELLA PREIPOFISI  AUMENTO PRODUZIONE ORMONE SOMATOTROPO  MAGGIORE DISPONIBILITA’ DI AMMINOACIDI  INCREMENTO SINTESI PROTEICA  ACCRESCIMENTO TESSUTI

11. Progestinici • Favoriscono la gravidanza • Regolano l’estro • Favoriscono l’aumento di peso

13. Esempi di studi sugli effetti di tali sostanze: • In animali da allevamento • McDonald, Farmacologia Veterinaria, 1987 • Su atleti dopati • Pedròn, Life Sciences, 2001 • Pedròn, Fertility and Sterility, 2000 • Testosterone nei bambini (holy terror) • Dabbs, Personality and Individual Diff., 2000 • Terapia in AIDS Wasting Syndrome • Strawford, Nutrition, 1997

14. SULFAMIDICI: MECCANISMO DI AZIONE PABA + PTERIDINA ACIDO DIIDRO- PTEROICO ACIDO TETRA- FOLICO

15. RISCHI TOSSICOLOGICI LEGATI ALL’ASSUNZIONE DI RESIDUI ANTIBIOTICI NEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE • RISCHI TOSSICOLOGICI DIRETTI • FENOMENI TOSSICI • SENSIBILIZZAZIONE • EFFETTI CANCEROGENI, MUTAGENI, TERATOGENI • RISCHI TOSSICOLOGICI INDIRETTI • ANTIBIOTICO-RESISTENZA

16. Normativa 2377/90/CE 22/96/CE 23/96/CE 508/99/CE 657/02/CE La UE ha creato un quadro normativo molto severo nel campo della sicurezza alimentare con una serie di provvedimenti atti a tutelare la salute dei consumatori • Molte sostanze usate in zootecnia come promotori della crescita sono state messe al bando o ne è stato limitato l’utilizzo • Sono state fissate regole precise per i controlli sia a livello di produzione che di distribuzione

18. USA Legislation The FDA (Food and Drug Administration ) established as acceptable levels in animal tissue the following concentrations: • 0.120 ppb for oestradiol • 3.00 ppb for progesterone • 0.64 ppb for testosterone

19. ALLEGATO I DELLA DIRETTIVA 96/23/CE CATEGORIA A - Sostanze a effetto anabolizzante e sostanze non autorizzate 1) Stilbeni, loro derivati e loro sali e esteri2) Agenti antitiroidei3) Steroidi4) Lattoni dell'acido resorcilico (compreso lo zeranolo) CATEGORIA B - Medicinali veterinari e agenti contaminanti 1) Sostanze antibatteriche, compresi sulfamidici, chinoloni2) Altri prodotti medicinali veterinari3) Altre sostanze e agenti contaminanti per l'ambiente

20. Chimica Analitica • La chimica analitica è la branca della chimica che copre le attività volte all'identificazione, alla caratterizzazione chimico-fisica e alla determinazione qualitativa e quantitativa dei componenti di un determinato campione • analisi qualitativa: rivela la presenza e l'identità chimica dell'analita in un campione • analisi quantitativa: stabilisce in termini numerici la quantità di uno o più analiti in un campione • limite di rivelabilità: è la minima quantità di analita determinabile per mezzo di una tecnica analitica

21. Riferibilità: “proprietà del risultato di una misura che attesta una relazione con riferimenti stabiliti, generalmente campioni nazionali o internazionali, attraverso una catena ininterrotta di confronti, ognuno dei quali presenta un’incertezza definita” Validazione: “conferma sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista, sono stati soddisfatti”

22. Ricerca in Chimica analitica • Le innovazioni volte a massimizzare le prestazioni analitiche delle metodiche di conferma, in termini di limite di rivelabilità e di capacità di identificazione, hanno una ricaduta diretta sulla qualità della vita. • Non si tratta solo di ricerche speculative, ma una migliore qualità delle metodiche analitiche porta come conseguenza una maggiore conoscenza in campo ambientale, merceologico, biomedico, etc.

23. METODI DI SCREENING: si tratta di metodi usati per rivelare la presenza di un analita o di una classe di analiti alla concentrazione che interessa. Questi metodi hanno un’elevata produttività e vengono usati per selezionare ampi quantitativi di campioni potenzialmente positivi. Il loro scopo è quello di evitare risultati erroneamente negativi. • - METODI DI CONFERMA: si tratta di metodi che forniscono informazioni complete o complementari che consentono l’identificazione dell’analita con certezza, alla concentrazione che interessa. Questi metodi sono intesi ad evitare risultati erroneamente positivi, nonché ridurre il più possibile risultati erroneamente negativi.

24. 2.2. METODI DI SCREENING In ottemperanza alla direttiva 96/23/CE, sono utilizzate per finalità di screening solo quelle tecniche analitiche la cui validazione può essere dimostrata in modo documentato e rintracciabile e che hanno un tasso di falsi conformi inferiore al 5 % (errore β) al livello di interesse. Nel caso di un sospetto risultato non conforme, tale risultato è confermato per mezzo di un metodo di conferma.

25. 2.3. METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGANICI I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici devono fornire informazioni sulla struttura chimica dell'analita. Di conseguenza, i metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi. Se una singola tecnica non dispone di sufficiente specificità, la specificità desiderata deve essere ottenuta per mezzo di procedure analitiche consistenti in combinazioni adeguate.

29. Precisione e Accuratezza I termini precisione e accuratezzasono messi in relazione con gli errori casuali e sistematici. • Una misura è tanto più precisa quanto più i singoli valori misurati in condizioni di ripetitibilità si concentrano intorno alla media della serie di misure effettuate. • La variabilità dei risultati viene quantificata nella deviazione standard. • Si preferisce quantificare la precisione con il coefficiente di variazione, in genere espresso in percentuale. • L'accuratezza esprime invece l'assenza di errori sistematici nella misura: • una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure si approssima al valore vero della grandezza. • Anche l'accuratezza è spesso espressa come rapporto fra l'errore sistematico e il valore della grandezza.

30. Precisione e accuratezza Esempi di risultati ottenuti da misure di diverso grado di precisione e di accuratezza. Ad esempio il caso b) mostra misure effettuate con maggiore precisione, ma con peggiore accuratezze del caso c). Il caso d) è quello peggiore sia per quanto riguarda la precisione che l'accuratezza.

33. La Funzione Gaussiana • Una funzione gaussiana è una funzione della seguente forma: dove µ e σ rappresentano la popolazione media e lo scarto quadratico medio (o deviazione standard). L'equazione della funzione di densità è costruita in modo tale che l'area sottesa alla curva rappresenti la probabilità. Perciò, l'area totale è uguale a 1.

34. La distribuzione normale

35. La deviazione standard La deviazione standard o scarto quadratico medio è una misura della variabilità di una variabile casuale ed ha la stessa unità di misura dei valori osservati. In pratica misura la dispersione dei dati intorno al valore atteso. • dove                                 è la media aritmetica.

36. La deviazione standard • Se si conosce solo un campione della popolazione, si sostituisce il fattore 1 / n con 1 / (n − 1), ottenendo come nuova definizione: A partire dalla deviazione standard si definisce anche la deviazione standard relativa come il rapporto tra σx e la media aritmetica dei valori:

40. COMMISSION DECISION 2002/657/CE 12 august 2002 on analytical methods performance 2.3 CONFIRMATORY METHODS FOR RESIDUES AND ORGANIC POLLUTANTS … method based only on chromatographic analysis without spectrometric detection are not suitable as confirm methods … • Identification Points (Ips): • LR-MSn • HR-MSn • Precursor Ion 1 • Product Ion 1.5 • Precursor Ion 2 • Product Ion 2.5

41. Develope an Analytical Method • Extraction • Analysis

42. Metodi analitici tradizionali • Estrazione liquido/liquido (L/L) e analisi gascromatografica • (Busico, J.of H. R. Chrom., 1992) • Estrazione (L/L) e determinazione in LC/MS • (Joos, Anal. Chem.,1999) • Pretrattamento del campione, SPE, LC-MS/MS • (Draisci, J.Chromat., 2000)

43. Estrazione MSPD • Dispersione della Matrice in Fase Solida: • Omogeneizzazione • Disgregazione cellulare • Purificazione • Vantaggi: • Procedura rapida e semplice • Basso consumo di solventi

44. Procedura di Estrazione

45. ASE (Accelerated Solvent Extraction)

46. Diagramma a blocchi di un generico spettrometro di massa. Il campione, immesso nello spettrometro dal dispositivo d’introduzione viene ionizzato nella sorgente dando luogo ad un fascio di ioni positivi o negativi che vengono separati dall’analizzatore di massa in funzione al rapporto m/z e rivelati da un detector che trasforma il fascio ionico in un segnale elettrico; quest’ultimo viene registrato ed elaborato da un computer in uno spettro di massa

47. Spettrometria di massa tandem • La Spettrometria di Massa MS/MS è una tecnica analitica potente ed altamente specifica • Le molecole vengono ionizzate in una sorgente, che immette il flusso ionico nell’analizzatore • Il sistema a quadrupoli seleziona le masse di interesse e le conduce al rivelatore (CEM) • Questa tecnica consente di raggiungere livelli di sensibilità elevatissimi, quindi risulta essere particolarmente adatta per la ricerca di residui in tracce

48. Strumenti a Quadrupolo

49. Ionizzazione a Pressione Atmosferica  ESI APCI 

50. Meccanismo Triplo Quadrupolo • Il primo quadrupolo (Q1) seleziona lo Ione Precursore • Il secondo quadrupolo agisce come cella di frammentazione attraverso la collisione con molecole di Azoto • Il terzo quadrupolo seleziona i frammenti di interesse per una identificazione inequivocabile