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Vectores

Vectores. Plásmidos . Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de clonado , son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en

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Presentation Transcript

  1. Vectores Plásmidos. Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. vectores de expresión, poseen toda la información necesaria para llegar expresar una secuencia aminoacídica.

  2. PLASMIDOS : moléculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma VECTORES DE CLONADO Características: • Son pequeños (miles de pares de bases) • son circulares • tienen un único origen de replicación • sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción • gran numero de copias • marcadores que permitan su reconocimiento

  3. Sitios de restricción únicos Marcadores genéticos (permiten selección de transformantes) Orígen de replicación Características generales de un vectores de clonado: mcs pBR322 4361 bp Tamaño pequeño (mayor eficiencia de transformación)

  4. Características generales de un Vector de Expresión: • sitios de corte de enzimas de • restricción • un promotor

  5. Características generales de un Vector de Expresión: • sitios de corte de enzimas de • restricción • un promotor

  6. MCS atg Sec Enhancer Tata Box Sec. Kosak Características generales de un Vector de Expresión: • sitios de corte de enzimas de • restricción • un promotor

  7. Características generales de un Vector de Expresión: • sitios de corte de enzimas de • restricción • un promotor • un sitio de unión a ribosoma • un terminador y sitio de poliadenilación • marcadores de selección • origen de replicación • tamaño pequeño

  8. Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal?

  9. Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión cgatG AATTCatgtcc gcatCTTAA Gtacag Vector Inserto AATTCatgtcc AATTCatgtcc Gtacag Gtacag aatacG AATTCtacc ttaagCTTAA Gatgg aatacG aatacG ttaagCTTAA ttaagCTTAA Ej: Vectores serie 1

  10. Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión cgatG AATTCatgtcc gcatCTTAA Gtacag Vector Inserto aatactG ttaagaCTTAA AATTCatgtcc Gtacag aatactG AATTCtacc ttaagaCTTAA Gatgg AATTCatgtcc aatactG Gtacag ttaagaCTTAA Ej: Vectores serie 2

  11. Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión La resistencia del plasmido

  12. Que tenemos que tener en cuenta para elegir el vector a utilizar? Proteína de fusión en el N o en el C terminal? Que este en fase con la proteína de fusión La resistencia del plasmido El nivel de expresión de la proteína

  13. El nivel de expresión depende del promotor Promotores Inducibles: se mantienen “apagados” y son inducidos por algún cambio en el medio (inductor, cambio de T).Ej: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona Constitutivos: siempre están transcribiéndose.Ej SV40, RSV,CMV

  14. se corta el ADN de interés y el vector con la misma enzima de restricción • se ligan los fragmentos generándose un vector recombinante • se transforman células del organismo huésped - se seleccionan las que portan el plásmido - Obtención de grandes cantidades de plásmido Proceso de clonado:

  15. Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos Métodos químicos: DEAE-Dextrano Coprecipitados de CaPO4 Lípidos cationicos Métodos físicos: Biobalistica Microinyección Electroporación

  16. Objetivo de la transfección • Expresión de proteínas para su purificación • Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular • Estudio de promotores y elementos regulatorios • Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, • postraduccionales, etc. • Interacción de proteínas • Clonado • Terapia génica

  17. Métodos químicos

  18. Biobalistica Microinyección Electroporación Métodos físicos:

  19. Consideraciones para transfección con lípidos cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección del promotor Cantidad de DNA

  20. Transfección estable y transiente

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