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Ciclo di Calvin

Ciclo di Calvin. The Calvin “Lollipop” for exposing algae to 14 CO 2. Come inizia la fotosintesi?. Esperimenti di marcatura (pulse and chase) hanno messo in evidenza che il primo composto dove viene incorporata la CO 2 radioattiva è un C3 (il 3-PGA, acido 3-fosfoglicerico).

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Presentation Transcript

  1. Ciclo di Calvin

  2. The Calvin “Lollipop” for exposing algae to 14CO2

  3. Come inizia la fotosintesi? Esperimenti di marcatura (pulse and chase) hanno messo in evidenza che il primo composto dove viene incorporata la CO2 radioattiva è un C3 (il 3-PGA, acido 3-fosfoglicerico) La marcatura si sposta molto velocemente su diversi altri composti (la vita media è bassa)  problemi di rifornimento

  4. Il ciclo di Calvin è suddiviso in tre fasi:

  5. RuBP + CO2 2 x 3-PGA C5 + C1 = 2 x C3 Rubisco 2 - H C O P O 2 3 - O O C O C H C O H H C O H - 2 O P O H C 3 2 H C O H 2 - H C O P O 2 3 Ribulose 1 ,5-bisphosphate 3 - phospho - glycerate ( RuBP)

  6. Carbossilazione/Riduzione

  7. Fase di riduzione Phosphoglycerate Glyceraldehyde 3 - phosphate kinase dehydrogenase - - 2 O O P O O O 3 + A T P A D P N A D P H N A D P C C H O C H C O H H C O H H C O H P - - - 2 2 2 O P O H C H C H C O P O O P O i 2 2 3 3 2 3 3 - phospho - glyceraldehyde - 1,3 - bisphospho - 3 - phosphate glycerate glycerate ATP e NADPH sono prodotti nella fase luminosa Il carbonio carbossilico è ridotto a carbonile (aldeide)

  8. Rigenerazione 2 GAP diventano F1,6P e poi F6P

  9. Rigenerazione (2) Eritrosio5P + GAP = Sedoeptulosio1,7BP F6P + GAP = Xilulosio5P + Eritrosio5P

  10. Sedoeptulosio7P + GAP = R5P + Xylulosio5P Rigenerazione (3)

  11. Bilancio del ciclo Per ogni CO2 vengono prodotte due molecole di 3-PGA • 2 x ATP • 2 x NADPH • 2 elettroni per NADPH • 2 fotoni per elettrone • 2x2x2 = teoricamente8 fotoni per CO2 (se ATP è prodotto in quantità sufficiente) • 1ATP aggiuntivo per ogni CO2 richiesto nella reazione della Fosforibulokinasi 3 CO2 + 9 ATP + 6 NADPH + 6 H+ + 8 H2O   C3H6O3-P + 9 ADP + 8 Pi + 6 NADP+ + 3 H2O + 3 O2

  12. Bilancio energetico per 1 Glucosio-P I prodotti della fase luminosa quanta energia possiedono? • 18 x ATP e 12 x NADPH Corrispondono a quanti Joule? In totale: 3126 kJ/mol 18 x 29 kJ/mol 12 x 217 kJ/mol Quanta energia in 8 moli di fotoni di luce rossa (x 6 CO2)? 6 x 8 x 175 kJ/mol = 8400 kJ Quanta energia deriva dalla combustione di una mole di esoso? 2804 kJ (ed è la quantità minima richiesta per sintetizzarla) 6 CO2 + 18 ATP + 12 NADPH + 12 H+  C6H12O6-P + 18 ADP + 17 Pi + 12 NADP+ + 6 H2O

  13. Efficienza Energia ricavata / energia investita • 3126 / 8400 = 33 % Efficienza della fotosintesi • 2804 / 3126 = 83 % Efficienza del Calvin

  14. La termodinamica del ciclo di Calvin * * * * * * * * Alcune reazioni mostrano un differenza in energia libera molto grande e negativa e saranno spostate decisamente verso i prodotti Secondo la biochimica classica queste sarebbero le reazioni che regolano il flusso

  15. Rubisco ID card • Enzima composto da 8 subunità grandi e 8 subunità piccole (L8S8) • Subunità L codificata dal genoma plastidiale e porta il sito attivo (all’interfaccia tra due subunità L) • Sububità S codificata dal genoma nucleare e non catalizza la reazione (nessun residuo partecipa al sito attivo)

  16. Altre 4 subunità S si trovano dall’altra parte L S L Figure 8.2.A   A model for the structure of rubisco in chloroplasts from higher plants. Rubisco consists of 8 large (L) and 8 small (S) subunits arranged as 4 dimers. Small subunits are shown in red (only four of the small subunits are seen), large subunits are shown in blue and green, in order to show the boundaries of the dimers. (From Malkin and Niyogi 2000.)

  17. RuBP Carboxylase – meccanismo postulato: Estrazione di un H+ dal C3 del ribulosio-1,5-bisfosfato promuove la formazione di un intermedio enediolato. Un attacco nucleofilo sulla CO2 porta alla formazione di un intermedio b-keto acido, che reagisce con acqua per formare 2 molecole di 3-phosphoglycerate.

  18. La Rubisco in realtà catalizza due diverse reazioni I due substrati sono simili (lineari e con una estremità identica) per cui è difficile discriminare La molecola di O2 risulta più piccola di CO2 per cui è difficile che non entri nel sito attivo

  19. Perchè un’attività apparentemente dannosa? L’attività ossigenasica della Rubisco è un male evitabile? (Occorrerebbe quindi solo cercare varianti dell’enzima capaci di discriminare meglio tra i due substrati). Oppure l’attività è inevitabile (dal punto di vista catalitico) o addirittura necessaria perché svolge qualche funzione importante? E’ probabile che sia inevitabile e ultimamente utile:  inevitabile perché la CO2 è molto meno abbondante dell’O2

  20. 210/0.35 = 600 265/11.7 = 22.6 Concentrazione dei gas a 25°C La CO2 pur essendo a bassa concentrazione nell’aria, si arricchisce (scioglie preferenzialmente) nell’acqua

  21. Come varia [CO2] con la temperatura? α = α (T) [CO2] (in μM) = Pp. CO2α 106/22.4 All’aumentare della temperatura, la solubilità di O2 e CO2 scende, ma quella della CO2 scende più velocemente

  22. Ciclo fotorespiratorio Il ciclo fotorespiratorio è un ciclo parassita!! Immagini da: Buchanan et al. Biochemistryy and Molecular Biology of Plants

  23. Glutamate synthase (GOGAT-glutamine 2-oxoglutarate aminotransferase) Ciclo fotorespiratorio Compartimenti, enzimi e reazioni

  24. Es. mutanti nella Glutammato Sintetasi cloroplastica (Fdx dipendente) crescono ad alta CO2 ma non in aria (clorosi). Cosa succede se blocchiamo il ciclo? Mutanti alterati negli enzimi del ciclo accumulano gli intermedi e hanno un fenotipo caratteristico Nella fotorespirazione si accumula NH3

  25. Esempi di mutanti che richiedono alta CO2: Phosphoglycolate phosphatase Catalase Serine trans-hydroxymethylase Dicarboxylic acid translocator Glu synthase Gln synthase Ser/Glyox amino transferase Rubisco Attivasi I mutanti mostrano tutti clorosi a [CO2] ambientale. La semplicità dello screening (clorosi in aria, ma non ad alta CO2) ha permesso l’isolarmento di molti mutanti. E’ stato di fatto l’isolamento e lo studio dei mutanti che ha permesso di delucidare il ciclo fotorespiratorio Il ciclo PR è necessario per riciclare il fosfoglicolato & intermedi

  26. Assimilazione netta in funzione di [CO2] e [O2] [CO2](ppm)21%O2 2%O2 110 10 150 320 565 1076 640 804 1144 La differenza è imputabile alla fotorespirazione Che peso ha in vivo la fotorespirazione? Per temperature superiori ai 30°C, l’assimilazione netta può diminuire del 60% per una pianta C3 Valore vicino a quello naturale

  27. Come avviene la competizione tra CO2 e O2? La competizione tra CO2 e O2 per il complesso Rubisco-enediolato si traduce in cinetica standard di inibizione competitiva tra i due gas Il valore di Km viene aumentato: Km’=Km(1+I/Ki)= Km•α L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato

  28. La Vm nell’inibizione competitiva è la stessa!!!

  29. Poniamo: C = [CO2] O = [O2] Vc= VmaxCarbossilazione Vo= VmaxOssigenazione Kc= KmCO2 = KIOss. Ko= KmO2 =KICarb.

  30. Fattore di specificità relativo Srel (φ) Se riusciamo a calcolarci vc/vo per un dato rapporto di CO2/O2, allora riusciamo a ricavare il valore di Srel(indicato come φ nel libro) che sarà poi utilizzabile come costante. Per ogni RuBP ossigenato si libera una glicina e quindi solo 0.5 molecole di CO2 A = Assimilazione = vc- 0.5vo- Rd A=d[CO2]/dt = 0 Quando A=0 siamo al punto di compensazione della CO2 La respirazione al buio (Rd, Dark Respiration) è in genere bassa alla luce (e comunque difficile da misurare quando la fotosintesi funziona) per cui si trascura.

  31. Punto di compensazione della CO2 Punti di compensazione della CO2 (per una C4 e una C3 rispettivamente) Assimilazione

  32. Trascurando Rd e con A=0 abbiamo: vc = 0.5 vo vo = 2 vc Quanto vale la [CO2] al punto di compensazione? Vedi diapositive 18 e 19 [CO2] (in μM) = Pp. CO2α 106/22.4 =1.5

  33. In vivo: Se la Rubisco funzionasse in aria: Su 8 eventi: 7 Ossig. e 1 Carb. In acqua in equilibrio con aria (0.035%): In acqua al p.c. CO2 (0.0045%):

  34. Valori di Srel http://www.uib.es/depart/dba/plantphysiology/Grup%20de%20recerca/Tesi%20Jeroni%20en%20PDF/14%20Chapter10.%20Biochemistry%20of%20Rubisco.pdf

  35. C’è una relazione tra Srel e Kcat? • Rubisco is surprisingly inefficient (Kcat=2-8 s-1) • Srel varies between 20 and 280 (80-100 for higher plants) • A trade off: aumentare la velocità della reazione comporta una perdita di specificità • Quanto più l’enediolo nel sito attivo è in una configurazione contorta, tanto più la reazione è specifica per la CO2 e tanto più è difficile rilasciare i prodotti (enzima lento) Vedi Tcherkez et al. (2006) PNAS 103:7246-7251

  36. Regolazione della Rubisco L’attività della Rubisco (e di diversi altri enzimi) deve essere regolata, altrimenti…  I substrati tendono a scomparire e i prodotti ad accumularsi L’attività della Rubisco viene regolata a diversi livelli: * Quantità di enzima sintetizzato * Stato di attivazione (Rubisco attivasi, regolata a sua volta) * Presenza di inibitori … * Anche la disponibilità dei substrati influenza la reazione

  37. Stato di attivazione della Rubisco • La Rubisco presente in cellula non è attiva al 100% ma solo in parte • Può essere attivata incubando con alta CO2 e Mg++ (attività totale) • La % di attivazione cambia in base a fattori ambientali (illuminazione, disponibilità di acqua…)

  38. Carbamilazione della RuBisCO Lys 201 (spinacio) La RuBisCO viene attivata per carbamilazione di un residuo di lisina da parte di una molecola di CO2 che non interagisce con il sito attivo; la reazione viene favorita da [H+] bassa e [Mg++] alta. La reazione è favorita dalla pesenza di Rubisco attivasi

  39. RuBisCO attivasi La RuBisCO attivasi aiuta il rilascio del substrato (o di inibitori) che impediscono la carbamilazione. La reazione è ATP dipendente

  40. La reazione è favorita alla luce Quando aumenta la luce la Rubisco viene attivata

  41. La CO2 agisce sia da attivatore (modulazione) o da substrato (catalisi) per la rubisco Forma attiva Forma inattiva

  42. CABP Intermedio di reazione Analogo dell’intermedio di reazione Transition state analogs of the postulated b-keto acid intermediate bind tightly to RuBP Carboxylase and inhibit its activity. Il 2-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphate (CABP) Alcune piante sintetizzano al buio degli inibitori della Rubisco. Sono analoghi dello stato di transizione, (es. CABP o carboxyarabinitol-1-phosphate CA1P). La Rubisco attivasi facilita il rilascio di CA1P dalla Rubisco, quando viene attivata in condizioni di illuminazione dal sistema della tioredossina.

  43. La regolazione tramite sulfidrili Enzimi regolati tramite Tioredossina: FBPasi SBPasi PRK NADP-GAPDH Rubisco Attivasi NADP-MDH CF1-ATPasi Phe-ammonia lyase ADP-G PPasi + G6P-DH PFK?

  44. Ciclo fotorespiratorio Il ciclo produce H2O2 che deve essere detossificata  la catalasi è necessaria per il ciclo Il ciclo produce NH3 che deve essere detossificata (è un disaccoppiante)  la Glutamina Sintasi (come la Glutamato Sintasi) è necessaria per il ciclo

  45. 21% O2 2% O2 Cosa succede in assenza di CO2 e con poco ossigeno alla catena di trasporto degli elettroni?  Il trasporto fotosintetico di elettroni viene ridotto drasticamente L’ossigeno aiuta a sostenere a catena di trasporto degli e- in assenza di CO2 Le piante differiscono per l’attività della Gln sintasi e quindi per la capacità fotorespiratoria (la GS serve per reincorporare l’ammoniaca) In assenza di CO2 e con poco ossigeno la FR funziona poco e quindi il consumo di ATP e di NADPH è molto ridotto Kozaki e Takeba (1996) Nature 384:557-560

  46. Caldo Freddo La fotorespirazione mantiene attiva la catena di trasporto degli elettroni in assenza di CO2 O2 riceve gli e- in assenza di CO2 La fotorespirazione conferisce un vantaggio (i mutanti che ne sono privi infatti muoiono) in condizioni di CO2 limitante

  47. Kebeish et al., (2007) Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nat Biotechnol. 25:593-9. Photorespiration redesigned Più che sulla eliminazione della FR conviene puntare su un ciclo più corto: piante che contengono gli enzimi 10 e 12 riciclano il gliossalato più efficientemente plant-like C2 cycle Three pathways cooperate in the metabolism of P-glycolate in Synechocystis: a plant-like C2 cycle, a bacterial-like glycerate path and a decarboxylation pathway

  48. Bibliografia Rubisco e il calvin: http://3e.plantphys.net/chapter.php?ch=8 Rubisco e fattore di specificità vedi: http://www.uib.es/depart/dba/plantphysiology/Grup%20de%20recerca/Tesi%20Jeroni%20en%20PDF/14%20Chapter10.%20Biochemistry%20of%20Rubisco.pdf * Tcherkez et al. (2006) PNAS 103:7246-7251 * Griffith (2006) Nature 441:940-941 * Kozaki e Takeba (1996) Photorespiration protects C3 plants from photooxidation Nature 384:557-560 Introduz. generale: Buchanan, Gruissem & Jones (2001) Biochemistry and Molecular Biology of Plants capitoli 8 (glutamato sintasi, p. 363-370) e 13

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