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Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza amminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici

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Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

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Presentation Transcript

  1. Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale Conoscenza proteina Malattia genetica Determinazione sequenza amminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomici che coprono il sito mappato Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche) Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac. Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche Caratterizzazione clone genomico Ricerca funzione proteica Ricerca delle mutazioni

  2. METODI DI CLONAGGIO

  3. CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE

  4. ENZIMI DI RESTRIZIONE

  5. DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO

  6. Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche N = ln (1 – P) / ln (1- a/b) a = dimensione media del frammento b = totale del genoma da clonare P = frammento qualunque sia clonato

  7. MAPPATURA FISICA COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA OTTENUTO DA: DNA GENOMICO TOTALE IBRIDI SOMATICO-CELLULARI PANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICI PANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI IBRIDI DA RADIAZIONE SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO

  8. STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana: somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica con marcatori polimorfici Nel maschio= 2644 cM Nella femmina = 4481 cM Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

  9. SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO

  10. GENOMA UMANO VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO Vettori plasmidici standard 0 - 10 Kb Vettori lambda 10 - 20 Kb Vettori cosmidici 30 - 44 Kb Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 Kb Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0.3 - 2.0 Mb Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti 1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = 75000 cloni indipendenti

  11. ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO: 1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu), 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

  12. DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO

  13. CHROMOSOME WALKING

  14. METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI IN CONTIGUI - Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre griglie ordinate - Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con ibridazione - Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR specifiche

  15. - Piastra agar con cloni ricombinanti • -Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) • Produzione filtro corrispondente

  16. Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia • - Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti • Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter) • - Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter • - Trasferimento automatizzato su filtro • 54 microtiter x 384 pozzetti = 20736 cloni = 4 genomi equivalenti

  17. ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO: 1) walking cromosomico: - con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni 2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione - presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu), 3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

  18. FINGERPRINTING PER MAPPA DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE Presenza nei diversi cloni di frammenti di restrizione della stessa dimensione

  19. FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO IRE = elementi ripetuti intercalati, es sequenze Alu: inter Alu-PCR

  20. ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA) STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCR La presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenza di quella STS all’interno di un clone

  21. ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

  22. ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

  23. Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

  24. PREPARAZIONE DI POOL DI DNA DI CLONI YAC E SCREENING CON PCR

  25. CLONAGGIO POSIZIONALE: UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI

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