Analyitsche Auswertung von Molecular Imprinted Polymeres per Gel-Elektrophorese

1. Henrik Scholz & Benjamin Wanitschka Analyitsche Auswertung von Molecular Imprinted Polymeres per Gel-Elektrophorese

2. Übersicht • Grundlagen der Elektrophorese • Gel-Elektrophorese • Herstellung MIPs • Messung eines MIPs und eines NIPs • Auswertung mit dem Densitometer • Grund für diese Analyse-Methode • Fragen?!?!

3. Grundlagen der Elektrophorese • unter Elektrophorese versteht man das wandern von gelösten ionischen Verbindungen in einem elektrischen Feld • sie findet oft ihren Einsatz um Aminosäuren, Proteine, Nucleinsäuren oder Lipine zu analysieren • Es gibt sowohl eine Elektrophorese die man in freier Lsg. durchführt als auch die sog. Träger-Elektrophorese wobei die 2. im Laboraltag überwiegt

4. Gel-Elektrophorese • Als Trägergel benutzt man hauptsächlich Polyacrylamid, es wirkt als eine Art Molekularsieb • → d. h. sie werden im elektrischen Feld proportional zu Ihrer Molekularmasse langsamer oder schneller wandern • Soll das Protein oder die Aminosäure nur nach seiner Größe und nicht nach seiner Ladung aufgetrennt werden, wird SDS zugesetzt

5. SDS-PAGESodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel elektrophoreses • dabei werden die meisten Proteine und Aminosäuren gebunden und erzeugen eine hohe negative Nettoladung der Moleküle • → dadurch unterscheiden sie sich nur noch in der Molekularmasse und werden dann danach aufgetrennt

6. Herstellung MIPs • - funktionelle Monomere dienen als Anker für das Templat und halten es während der folgenden Polymerization in Position • - nach entfernen des Templats aus dem gebildeten Polymer werden Andockstellen frei • -> diese soind komplementär zur Form und den funktionellen Gruppen des Templats • - die molekular geprägten Polymere kurz MIPs besitzen also ein Gedächtnis für ihr Templat und können es oder nahe Strukturen selektiv binden ähnlich den menschlichen Antikörpern

7. Herstellung MIPs

8. Messung eines MIPs und eines NIPs • Präparieren der SDS Gels: • 1. Separtion gel • Wasser • Separation Buffer • MBA Lsg. 30% 1 eq. • SDS • APS • TMEDA

9. Messung eines MIPs und eines NIPs • Präparieren der SDS Gels: • 2. Stacking gel • Wasser • Separation Buffer • MBA Lsg. 30% ca. 0.1 eq. • SDS • APS • TMEDA

10. Messung eines MIP´s und eines NIP´s • Probenvorbereitung • 10 µg des NIP´s und des MIP´s • 7 ml Puffer (pH 6,8) • 2 ml Glycerin • 0.4 ml SDS • 500 µL β-mercaptoethanol • Bromophenolblue um es kenntlich zu machen

11. Messung eines MIPs und eines NIPs • Running Buffer • 75,5 g Tris • 470 g Glycerin • 4 L Wasser • 250 ml 10% SDS

12. Messung eines MIPs und eines NIPs • Vorbereitung der Gels:

13. Messung eines MIPs und eines NIPs • Zunächst die Separation-Gel Lsg. Zwischen die beiden Glasplatten geben, polymerisieren • Dann die Stocking-Gel Lsg darauf geben und den „Kamm“ in der Halterung fest machen

14. Kammer für 2 Gels

15. Messung eines MIPs und eines NIPs • Nach Ende der Polymerisation kann der „Kamm“ entfernt werden und man kann nun den „Marker“, das NIP und das MIP auf das Gel aufgeben! • Der Marker dient als Vergleich da er eine genau festgelegte Auftrennung hat, die man im Densitometer mit den beiden Proben vergleichen kann

16. Messung eines MIP´s und eines NIP´s • Das auftragen der Proben erfolgt mit einer Eppendorf-Pipette

17. Messung eines MIPs und eines NIPs • Anschließend gibt man die Gelplatten in das Elektophorese-Gerät das mit der Running-Solution befüllt wurde

18. Messung eines MIPs und eines NIPs

19. Messung eines MIPs und eines NIPs

20. Messung eines MIPs und eines NIPs

21. Messung eines MIPs und eines NIPs • Nachdem man die Gels in das Gerät gestellt hat, stellt man es an und gibt die entsprechenden Parameter ein • Bei 50-60 mA ca. 30 Min.

22. Auswertung mit dem Densitometer • Nach der Gel-Elektrophorese wird das Gel mit einem Anfärbereagenz anfärbt und über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag mit viel Wasser mehrmals gewaschen um die Proteine oder Aminosäuren sichtbar zu machen! • Würde man die Gels nicht mit viel Wasser waschen dann hätte man ein komplett blaues oder rotes Gel und man könnte nichts erkennen und keine Auswertung vornehmen

23. Messung eines MIPs und eines NIPs

24. Auswertung mit dem Densitometer • Anfärbereagenz:

25. Auswertung mit dem Densitometer

26. Auswertung mit dem Densitometer • Man legt nun das Gel auf eine spezielle Glasplatte im Densitometer

27. Auswertung mit dem Densitometer • Das Densitometer misst die Absorption des Gels und daraus kann man die Menge an Substanz errechnen

28. Grund für diese Analyse-Methode • Der Grund für diese Methode ist, dass man überprüft ob die Polymere die man hergestellt hat so funktionieren oder wie gut sie funktionieren wie sie es sollen • NIP´s (Nonimprinted Polymeres) • Es ist das Polymer ohne Zusätze • MIP´s (Molecular Imprinted Polymeres) • Es bedeutet dass dieses Polymer ein Protein beinhaltet

29. Grund für diese Analyse-Methode • Wenn man nun die beiden gegeneinander auf dem Gel auftragt dann kann man genau vergleichen ob und wie gut das Polymer das man Synthetisiert hat funktioniert

30. Fragen?!?!

31. Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!