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Fonction de la forme  du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain :

Fonction de la forme  du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain : ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques. Angélique Gougelet Le 26 janvier 2007. Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire des anticancéreux UMR CNRS 8612

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Fonction de la forme  du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain :

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  1. Fonction de la forme  du récepteur des œstrogènes dans les cellules de cancer du sein humain : ouverture vers de nouvelles stratégies thérapeutiques. Angélique Gougelet Le 26 janvier 2007 Laboratoire de pharmacologie cellulaire et moléculaire des anticancéreux UMR CNRS 8612 Sous la direction du Dr. J.-M. Renoir

  2. Cancer du sein • 1er cancer féminin dans les pays occidentaux. • Chaque année en France : (Ligue Nationale contre la Cancer 2000) • 42 000 nouveaux cas • 12 000 décès • Facteurs de risque : D’après McPherson et coll. 2000, BMJ, 321: 624-628

  3. Traitements • Chirurgie : technique du ganglion sentinelle. • Radiothérapie: adjuvante ou néo-adjuvante. • Chimiothérapie : adjuvante ou néo-adjuvante : • protocole CMF : cyclophosphamide (agent alkylant) + méthotrexate et 5-FU (antimétabolites) ; • protocole FEC : 5-FU + épirubicine (inhibiteur des topoisomérases II) + cyclophosphamide ; • protocole ET : épirubicine + docétaxel (inhibiteur de la dépolymérisation des microtubules).

  4. O N OH (CH2)9SO(CH2)3CF2CF3 OH Œstrogènes et hormonothérapie • 50-60 % de cancers œstrogéno-dépendants ; • hormones stéroïdes impliquées dans le développement et la différenciation de l’appareil reproducteur et de la glande mammaire ; • liaison à un récepteur nucléaire (ER) : anti-œstrogènes : Nolvadex (SERM) Faslodex (SERD) ; • œstrone (E1), œstradiol (E2), œstriol (E3) synthétisés à partir des androgènes par action de l’aromatase ovarienne principalement : anti-aromatases : Fémara, Arimidex ; • Blocage des voies mitogéniques : anti-HER2 : Herceptin.

  5. AF-1 1 149 214 248 500 530 NLS LBD P-box ER 66 kDa A/B C D E F AF-2 1 180 263 302 553 595 ER 55 kDa dimérisation DBD NLS Récepteur aux œstrogènes • Récepteur nucléaire (NR3A) • Facteur de transcription • 2 isoformes : • ER clonée en 1985 (Walter et coll. PNAS, 82 : 7889-93). • ER clonée en 1996 (Kuiper et coll. PNAS, 93 : 5925-30; Mosselman et coll. FEBS lett, 392 :49-53). • 5 domaines fonctionnels : D’après Ogawa et coll. 1998, BBRC, 243: 122-6 C-term N-term N-term C-term

  6. LBD AF-1 DBD A/B C D E F 1 180 263 302 553 595 AF-2 53 96 1 149 214 248 500 530 • 96 % d’homologie au niveau du DBD ; • 53 % d’homologie au niveau du LBD ; • Facteurs de transcription : • Fonction de transactivation constitutive AF-1 • Fonction de transactivation ligand-dépendante AF-2 • Domaine AF-1 tronqué dans ER. C-term N-term ER 66 kDa N-term C-term ER 55 kDa

  7. Distribution tissulaire Cerveau : neuroprotection, humeur ER et ER Système cardiovasculaire : cardioprotection, vasodilatation ER tronqué et ER Sein : différenciation finale normal :20 % ER+ER+ cancer : 70 % ER++ER+ Foie : facteurs de coagulation, récepteurs aux lipoprotéines ER Poumons : ER Tractus gastro-intestinal : ER Tractus urinaire : ER Os : maintien de la densité osseuse ER et ER Tractus génital : ovaire : ER (thèque), ER (granulosa) utérus : ER> ER testicule : ER, ER prostate : ER

  8. ligand IP ligand hsp70 hsp90 p23 ER MAP kinases hsp90 ER p23 hsp70 AKT ER PKA machinerie transcriptionnelle corégulateurs POL TF transcription P P P Mécanismes d’action de ER membrane plasmique IP Enveloppe nucléaire nucléosome TATA GGTCAnnnTGACC ERE

  9. Compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la forme  du récepteur des œstrogènes. Mise au point et développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Rôle protecteur de ER • expression de ER diminuée dans les tissus invasifs ; • tumeurs ER+ mieux différenciées, moins agressives ; • propriétés antiprolifératives : • inhibition des cyclines (A, D1, E) ; • induction des inhibiteurs des kinases cycline-dépendantes p21waf1/cip1 et p27kip1 ; • propriétés inhibitrices de la transactivation ER-dépendante.

  10. ER Lignées cellulaires de cancer du sein HERB HE-5 MCF-7 MDA-ER- HERB HE-5 MCF-7 MDA-ER- ER ER RT-PCR Western blot ER • MCF-7 : modèle de référence ER++ ; • HE-5 : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme  de ER(Touitou et coll. JSBMB, 1991, 40 :231-7) ; • HERB : MDA-MB-231 transfectée de manière stable avec la forme  de ER(Mueller et coll. JBC, 2003, 278 : 12255-62).

  11. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  12. HAT HAT SWI/SNF TRAP220 Ac Ac Ac Ac CBP/p300 SRC1 TAF agoniste TF TF POL ER ER ERE nucléosome TATA Ac Ac transcription Modèle de transactivation de ER D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 : 775-81

  13. HDAC NCoR Ac HDAC HDAC2 SMRT sin3 Antagoniste mixte ER ER Ac ERE nucléosome TATA Ac Ac Ac Modèle de transrépression de ER D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 : 775-81

  14. HDAC NCoR HDAC HDAC2 SMRT sin3 nucléosome ERE TAF TATA TF TF POL Modèle de transrépression de ER D’après Moggs et Orphanides. 2001, EMBO Rep, 2 : 775-81

  15. Activation œstrogéno-induite • La séquence de l’ERE module les niveaux d’induction maximale (Imax). • L’ Imax d’un promoteur est atteinte pour différentes concentrations (Cmax) d’un même ligand. • Les concentrations nécessaires à l’activation maximale d’un promoteur varient avec le ligand. • Les concentrations de ligand nécessaires pour une activation maximale varie avec l’isoforme de ER. • La transactivation ER-dépendante est influencée par le contexte cellulaire. • + importante dans les cellules MCF-7 ; • promoteurs  répondeurs : • MCF-7 : tk > Vit > C3  0 MDA: Vit > tk  C3

  16. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendanteRôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  17. 0 + ER E2 E2 + ER gen gen + ER MCF-7 PR ER  la capacité transactivatrice de ER : • au niveau de promoteurs endogènes ou exogènes • quels que soient le type d’ERE et la lignée cellulaire considérés. Activité suppressive de ER Vit tk  non transfecté  0,1 µg ER 10 nM E2 ou 1 µM gen

  18. HE-5 MCF-7 Vit tk Vit tk ER +10 nM E2 (id.1 µM gen) ER +10 nM E2+TSA 1µM ER possède des propriétés de dominant négatif régulées par des processus de déacétylation ou par recrutement d’histone-déacétylases. Activité suppressive de ER et acétylation • Trichostatine A (TSA) = inhibiteur des histone-déacétylases.

  19. IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ERApproches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  20. AF-1/AF-2 de ER et transactivation œstrogéno-induite ER-AF-1 477 1 65 99 351 381 ER-AF-2 1 96 161 195 447 *** • Cellules MCF-7 et HE-5. • 2 gènes rapporteurs Vit et tk. • Transfection transitoire de 0,1 µg de ER mutants : N C N C • Exposition des cellules à 10 nM E2 ou 1 µM gen  1 µM (TSA) Importance de l’acétylation.

  21. ER ER 1/2 ER+TSA ER+TSA ER-AF-2 ER-AF-1 ER-AF-2+TSA ER-AF-1+TSA déAc HDAC CoR ER AF-2 AF-2 ER AF-1 AF-1 synergie synergie ER ERE ERE ERE AF-2 AF-2 ER ER-AF-2 ER ER-AF-2 +TSA CoA + - Ac Ac Au niveau de Vit dans les cellules MCF-7

  22. X 2 ER ER ER+TSA ER+TSA ER-AF-2 ER-AF-1 ER-AF-2+TSA ER-AF-1+TSA HDAC HDAC déAc HDAC ER AF-2 AF-2 ER AF-1 AF-1 synergie synergie ER ERE ERE AF-2 AF-2 ER ER-AF-2 ER ER-AF-2 +TSA CoA + - Ac Ac Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon le promoteur. Au niveau de tk dans les cellules MCF-7 23

  23. 12 8 ER Induction ER +TSA ER-AF-2 4 ER-AF-2+TSA 0 E2 1E-8 C DéAc HDAC ER AF-2 AF-2 AF-1 ER AF-1 ER ERE ERE ERE Les propriétés suppressives de ER sont différemment régulées selon la lignée cellulaire. Au niveau de Vit dans les cellules HE-5 24

  24. - + • ER AF-1  + faiblement ARNm PR. • région AF-1 de ER impliquée dans son activité suppressive sur PR. synergie de la région AF-2. • ER possède des propriétés de dominant négatif liées à sa région AF-1, régulées par : • acétylation / déacétylation de son domaine AF-1 ou des cofacteurs recrutés ; • recrutement d’histone-déacétylases ; • Thérapie ciblée sur le maintien de son activité. Sur le gène endogène PR dans les MCF-7 • ER  ARNm de PR de 50 %. TSA 1 µM actine MCF-7 MCF-7 + 0,1 µg ER PR • L’inhibition des HDAC : • bloque l’activité suppressive de ER. MCF-7 + 0,1 µg ER-AF-2 • potentialise l’activation induite par ER AF-1. 25

  25. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  26. L’ anti-œstrogène de référence : le tamoxifène • 50 % des tumeurs œstrogéno-dépendantes diagnostiquées répondent à cet agent. • Activité agoniste à l’origine de cancers secondaires de l’endomètre. • 40 % des patientes traitées rechutent par acquisition de résistances associées à : • Une diminution des concentrations intratumorales en Tam ; • Une altération de l’expression de ER ; • Une altération du niveau d’expression des corégulateurs de ER ; • Une hyperactivation des voies de signalisation œstrogéno-dépendantes. • recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques : • Anti-œstrogènes purs; • Inhibiteurs de la hsp90 ; • Inhibiteurs des histone-déacétylases.

  27. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2de ERApproches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique : Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  28. Anti-œstrogènes mixtes : Molécule à activité agoniste ou antagoniste selon les tissus. Le tamoxifène référence pour le traitement du cancer du sein. Anti-œstrogènes purs : N N 0 O O S OH OH Tamoxifène Raloxifène OH (CH2)9SO(CH2)3CF2CF3 OH Anti-œstrogènes SO2 CF2CF3 O OH H H H H O ICI 182,780 RU 58668 • Pas de transactivation possible par gêne stérique. • Dégradation protéasome-dépendante de ER. • Indiqués pour le traitement de seconde intention des cancers du sein résistants au Tam.

  29. AE et stabilité de ER ER ER MCF-7 HE-5 HERB • L’OHT stabilise les 2 formes de ER. • Le RU induit une dégradation protéasomale : • durable de ER ; • transitoire de ER. RU ER ER ER OHT

  30. RU > OHT sur l’activité et la stabilité de ER. AE et transactivation œstrogéno-induite MCF-7 HE-5 HERB  Vit tk • Pouvoir inhibiteur équivalent des 2 AE dans les MDA-MB-231 : • HERB : 70 % sur Vit 60 % sur tk • HE-5 : 45 % sur Vit 45 % sur tk • Effet plus marqué du RU sur les cellules MCF-7 et MELN : • RU : 40 % sur Vit 75 % sur tk  100 % dans les MELN OHT :  sur Vit 55 % sur tk 85 % dans les MELN

  31. RU et cycle cellulaire MCF-7 MCF-7 + ER • Arrêt du cycle en G0/G1dans les cellules MCF-7 ER+ et ER+/ER+. NT • Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7. RU • La présence de ER dans les cellules MCF-7 : • induit la mort cellulaire ; •  l’activité pro-apoptotique du RU.

  32. MCF-7 MCF-7+ER NT OHT Activité bénéfique du RU sur les cellules MCF-7 ER+/ER+ par rapport à l’OHT. OHT et cycle cellulaire • Arrêt du cycle en G0/G1 <au RU. • Faible activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7. • Peu d’effet sur les cellules ER+/ER+ contrairement au RU.

  33. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ER Approches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  34. hsp90 La hsp90 : chaperon moléculaire de nombreuses protéines oncogènes Récepteurs stéroïdiens Récepteur des œstrogènes Récepteur de la progestérone Autres p53 Kinases Cdk4 Cdk6 Cdc2 AKT c-Raf-1 ErbB2 Cochaperons FKBP51/52 Cyp40 hsp70 p23 hsp40 CHIP Cycle cellulaire Apoptose Prolifération Croissance/Développement Cancer Angiogenèse D’après Maloney et Workman. 2002, Expert Opin Biol Ther, 2 : 3-24

  35. hsp70 foldosome poche de liaison auligand fermée hsp90 Hop ER hsp40 p23 ATP ADP p23 hsp90 poche de liaison auligand ouverte Hop ER hsp40 Hop immunophiline hsp70 hsp70 p23 hétérocomplexe mature IP hsp90 ER hsp90 et maturation de ER D’après Pratt et Toft. 2003, Exp Biol Med, 228 : 111-33

  36. Inhibiteurs de la hsp90 ATP/clientes ATP/clientes MEEVD N M C 1 236 272 629 732 radicicol novobiocine geldanamycine • Bloquent les sites de liaison à l’ATP : • en N-terminal : geldanamycine (GA) et radicicol (Rd) ; • en C-terminal : novobiocine (Nv). • Ubiquitinylation des protéines clientes immatures par l’E3 ubiquitine-ligase CHIP (C-terminus of hsp70-interacting protein). • Dégradation par le protéasome.

  37. Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les 2 lignées cellulaires ER+: Nv  Rd  GA • Effets comparables des 3 inhibiteurs sur les MDA ER+et ER-: Rd  GA  Nv • avantage en cas d’échappement thérapeutique de cellules ER+ ou ER-. • Pouvoir antiprolifératif influencé par le variant de ER exprimé dans les cellules. Activité antiproliférative des inhibiteurs de la hsp90 37

  38. GA > Rd > Nv  . • GA :  cyclines D1 et E ;  cdk2, 4 et 6 ;  cdc2 ;  c-Raf-1 ;  phospho-p70S6K ;  phospho-ERK. Inhibiteurs de la hsp90 et régulateurs du cycle cellulaire 3 h E2 100 nM ICI 182,780 10 nM GA 1 µg/mL MCF-7 72 h - + - + + - + + + p70S6K phospho-p70S6K c-Raf-1 phospho-p42/p44 cycline D1 cycline E cdk2 cdk4 cdk6 cdc2

  39. G1 S G2 M Rd GA ErbB2 Cycline D1 Rd GA Ras p53 Cdk4/6 HDAC Raf pRb Rd GA p21 E2F MEK Rd GA Cycline E Rd GA Cdc2 Cycline B Cdk2 ERK pRb E2F p85 PI3K p110 AKT mTOR P70S6K Inhibiteurs de la hsp90 et cycle cellulaire

  40. Activité pro-apoptotique des inhibiteurs de la hsp90 * * * • Peu d’effet sur les cellules MCF-7 :  absence de caspase 3 GA agent le plus puissant. MCF-7 HERB • Activité pro-apoptotique identique sur les 3 types de MDA. MERA MDA-ER-

  41. Activité et stabilité de ER - - - - - - + + + + + + MELN HERB * * * * * * C C E2 E2 GA GA E2+GA E2+GA Rd Rd E2+Rd E2+Rd Nv Nv E2+Nv E2+Nv 16 h C GA Rd Nv C GA Rd Nv MG132 5 µM - - + + ER ER ER protéine cliente de la hsp90 Inhibiteurs de la hsp90 = traitement de choix pour les cancers œstrogéno-dépendants • Inhibition de l’activité transcriptionnelle œstrogéno-induite des 2 ER : • Dégradation protéasome-dépendante des 2 formes de ER : 42

  42. Plan IntroductionTransactivation œstrogéno-dépendanteER répresseur de la transcription ER-dépendante Rôles des fonctions de transactivation AF-1 et AF-2 de ERApproches thérapeutiques à visée anti-œstrogénique :Avantages du RU 58668Les ligands de la hsp90Les inhibiteurs d’histone-déacétylasesConclusions et perspectives

  43. HDAC1 HDAC2 Classe I HDAC3 HDAC8 HDAC11 Classe IV HDAC6 Classe IIb HDAC10 HDAC4 HDAC5 HDAC7 Classe IIa HDAC9 Les histone-déacétylases (HDAC) D’après De Ruijter et coll. 2003, Biochem J, 370 : 737-49 • 18 membres en 4 classes : + Sirtuines 1 à 7 : Classe III. • Inhibiteurs d’HDAC = stratégie anticancéreuse prometteuse : • Classes I et II impliquées dans la prolifération des cellules cancéreuses ; • HDAC1 et HDAC6 surexprimées dans les cellules de cancer du sein.

  44. Inhibiteurs des HDAC

  45. MCF-7 MCF-7+ER * * NT * * * * * * HERB MDA-C MCF-7 HE-5 TSA • Activité antiproliférative de la TSA : • = à forte concentration sur les cellules ER+ et ER- ; • > à faible concentration sur les cellules ER+. • Accumulation des cellules en G2/M. • Forte activité pro-apoptotique dans les cellules MCF-7 et MCF-7 ER+. TSA et cycle cellulaire 45

  46. Inhibition des HDAC et transactivation de ER X2 X2 X8 X6 X3 X6 X3 X4 Activité de la TSA modulée par la lignée cellulaire, l’isoforme de ER et le promoteur ciblé. • Activation de la transcription œstrogéno-induite de ER : • > au niveau de tk dans les cellules MCF-7 et HE-5 ; • > dans les cellules MCF-7 par rapport aux HE-5. • Activation plus forte de la transcription ER-dépendante dans les cellules HERB, en présence de génistéine. 46

  47. Inhibition des HDAC et stabilité de ER ARNi HDAC1 MG132 5 µM - + - + + + MCF-7 HE-5 HERB MDA-C   HDAC1  L’HDAC1 paraît être un régulateur clé des effets induits par la TSA. À l’origine des niveaux d’expression différents de ER en présence de TSA et après suppression de l’HDAC1? TSA 1 µM - + ER MCF-7 ER HE-5 ER HERB 16 h • TSA  ER et ER dans les MDA-MB-231 mais  ER dans les MCF-7. • Dégradation protéasome-dépendante de ER dans les cellules MCF-7. • Résultats similaires après suppression de l’expression d’HDAC1 par un ARNi spécifique • Le niveau d’expression d’HDAC1 varie avec la lignée cellulaire. 47

  48. Association RU/TSA et stabilité de ER RU 1 µM + + - + TSA 1 µM - + ER MCF-7 +- ER HE-5 ++ ER HERB 16 h Association RU/TSA prometteuse. - - • L’association RU/TSA : •  la stabilisation de ER induite par le RU dans les cellules HERB ; •  peu ER dans les cellules HE-5 par rapport au RU seul ; • potentialise la dégradation de ERinduite par le RU dans les cellules MCF-7.

  49. Association TSA/RU et transactivation de ER E2+OHT E2+OHT+TSA C C E2+TSA E2+TSA E2+RU E2+RU E2+RU+TSA E2+RU+TSA C E2+TSA E2+RU E2+RU+TSA Le RU inhibe la transcription œstrogéno-induite sans intervention des HDAC. L’inhibition induite par l’OHT requiert l’intervention de HDAC contrairement au RU. Association RU/TSA avantageuse par rapport à la combinaison OHT/TSA.  Vittk MCF-7 HE-5 HERB • Le RU conserve ses propriétés inhibitrices de la transactivation ER et ER-dépendante en présence de TSA (70 % ). • La TSA augmente l’activité agoniste de l’OHT dans les cellules MCF-7 et MELN. 49

  50. Effets combinés de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7 MCF-7 • La TSA induit toujours une accumulation des MCF-7 en G2/M en présence de RU. • Addition des propriétés pro-apoptotiques de la TSA et du RU sur les cellules MCF-7. • La TSA conserve ses propriétés antiprolifératives en présence de RU. C RU TSA RU+TSA

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