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Cancer du sein Statut HER2 et IHC L’importance de la phase technique

Cancer du sein Statut HER2 et IHC L’importance de la phase technique. Détermination du statut HER2 par IHC et FISH/CISH. Oncogène HER2, chr 17q 1-2. Surexpression de la protéine. Activation par amplification. Tumeurs HER2 (+++). Détermination du statut de HER2/neu.

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Cancer du sein Statut HER2 et IHC L’importance de la phase technique

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Presentation Transcript

  1. Cancer du seinStatut HER2 et IHCL’importance de la phase technique

  2. Détermination du statut HER2 par IHC et FISH/CISH

  3. Oncogène HER2, chr 17q1-2 Surexpression de la protéine Activation par amplification

  4. Tumeurs HER2 (+++)

  5. Détermination du statut de HER2/neu Hybridation in situ en fluorescence (FISH)et Chromogenic in situ hybridization (CISH) : amplification du gène Immunohistochimie (IHC) : expression de la protéine

  6. Les cellules tumorales des cancers du sein Nombre de chromosomes anormaux +++( aneuploïdie) Dr AURIAS, Institut Curie, Paris HER-2: 17q21.1

  7. Sur-représentation d’HER-2 • des polysomies 17 • des translocations déséquilibrées du 17q 6 copies de HER2 Dr COUTURIER, Institut Curie, Paris Translocation déséquilibrée 17q

  8. Est-ce que le statut HER2 est stable,ou peut être acquis au cours del’évolution tumorale ? Travail de Meng S PNAS 2004

  9. Meng S, PNAS 2004 • Etude sur 33 patientes stade I à IV • Comparaison de l’amplification HER2 dans les cellules tumorales circulantes et dans la tumeur primitive • Puis même étude sur 24 patientes HER2 -

  10. Etude initiale sur 33 patientes HER2- • Le statut HER2 est concordant pour 29 patientes (11 +/+et 18 -/-). • Il est discordant pour 4 patientes présentant un statut HER2 tumoral positif (par FISH) et négatif sur les CTC ; • Pour 3 de ces patientes, un traitement par chimiothérapie et/ou Herceptin avait été instauré; faussant probablement les résultats, par la destruction des CTC HER2 positives.

  11. 2ème étude sur24 patientes HER2- • Evaluation sur CTC chez 24 patientes initialement HER2 « négatives » et en rechute • 9 ont acquis un statut HER2 « positif » lors de la progression • Les 9 patientes ont alors reçu Herceptin® 2RP et une RC

  12. Critiques de l’étude • Les niveaux d’amplification (rapport HER2/chromosome 17) sont deux à trois fois plus élevés dans la tumeur initiale par rapport aux CTC. • Ceci est assez troublant car l’amplification génique est un phénomène stable. • Pourquoi les cellules métastatiques comme les CTC présentent des taux d’amplification plus faibles que ceux de la tumeur initiale ? • Pour les CTC qui acquièrent une amplification (tumeur initiale négative), les taux sont également faibles (de l’ordre de 2.2 soit inférieur à la valeur limite reconnue pour une amplification).

  13. Pourquoi les CTC présentent elles des niveaux d’amplification si bas ? • Plusieurs hypothèses se discutent : • Le statut HER2 n’a pas été correctement évalué dans la tumeur initiale (problème technique, problème de fixation tissulaire) • La CTC présente surtout une hyperploïdie du chromosome 17 entraînant essentiellement une sur représentation de HER2, ce qui expliquerait ces valeurs limites d’amplification  • La cellule métastatique acquiert vraiment une amplification de HER2, par sélection d’un clone HER2+ lors des nombreux traitements reçus par ces patientes pour certaines en phase terminale

  14. Conclusion Si ces résultats sont confirmés,il faudra peut être re-tester les patientes négatives sur la tumeur initiale,au niveau des métastases

  15. Amplification  Surexpression x10 • Cible des traitements anti HER-2 = protéine HER-2 exprimée à un haut niveau (IHC 3+) • Surexpression à haut niveau d'HER-2 (3+) = liée à l'amplification du gène • Les surreprésentations donnent des hyperexpressions de faible niveau Leur réponse au traitement n'est pas connue  Objectif : détection des hyperexpressions/amplifications vraies

  16. Détermination du statut HER-2par FISH • Technique idéale ‘’gold-standard’’ : - reproductibilité > à l'IHC - échecs identifiables (fixation BOUIN ++) - résultat sous forme d'une variable discontinue (numérique) • Plusieurs limitations : - investissement en microscopie en fluorescence - coût plus élevé que l'IHC (210 €) - nécessité d'un personnel entrainé - fixation FORMOL ou Formol-Ac Acétique • Indications : - calibration de l'IHC - détermination du statut des IHC 2+

  17. Hybridation in situprincipe • Visualisation in situ du nombre de copies d'un gène • Sur coupe à partir de tissu congelé, ou fixé • Lecture en référence à l'histologie, • identification des structures invasives • intérêt par rapport aux méthodes moléculaires +++ • La sonde visualisée soit par l'intermédiaire . d'un fluorochrome (FISH) technique de référence . d'un chromogène (CISH)

  18. FISH HER-2 • 2 types de kits approuvés FDA - sonde HER-2 seule (Oncor/Ventana; Zymed)  n. de copies HER-2 - sonde HER-2 + cent 17 (Vysis/Abott; Dako, …)  rapport copies HER-2 / copies cent 17 Un impératif : distinguer les amplifications des sur-représentations

  19. FISH HER-2 amplifications sur-représentations >10copies centromère 17 HER-2 6 copies HER-2 cent 17

  20. FISH HER-2 recommandations - HER-2 : > 6 copies - HER2/cent 17 : > 2.2 * • Les amas de signaux (hsr) signent les amplifications. • Donner les nombres de signaux HER-2 • Vérifier HER-2/cent 17 en cas de 6-7 copies HER-2 • Archiver les images (contrôle de qualité) Recommandation : afin de ne détecter que les amplifications vraies  seuil ratio HER2/Cent 17 > 3 *ASCO 2006, recommandations JCO

  21. Cas non amplifiés CISH Dr ARNOULD, Dijon 2 spots 5 spots

  22. Cas avec amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon

  23. Faible amplification CISH Dr ARNOULD, Dijon 6 spots Vérification par FISH du centromère du chr 17

  24. Immunohistochimie : avantages • Visualisation de la protéine in situ • spécificité de l’évaluation de la surexpression • quantification de la protéine cible • Largement répandue • Sensible • Automatisable et standardisable • Faible coût • Polyclonaux (A0485, Herceptest®), monoclonaux (CB11, PathwayTM de Ventana, SP3 de lapin …)

  25. Cas (++) Faible niveau d’amplification 8 – 10 copies du gène

  26. Cas (+++) Fort niveau d’amplification > 15 copies du gène

  27. IHC : inconvénients • Grande sensibilité • Fixation inadéquate : altération des antigènes • Pas de seuil de positivité consensus

  28. Concordance statut HER2 FISH et IHC Si… • immunohistochimie calibrée • nombre de cas testés par an suffisant 90%

  29. « Discordances » FISH / IHC < 10% • amplification sans surexpression • surexpression sans amplification

  30. 65 à 80% des cas Pas d’amplification Pas de surexpression

  31. 15% à 30% des cas +++ Fort niveau d’amplification Surexpression forte

  32. Surexpression modérée ++ 5% des cas dont : 40% Faible niveau d’amplification 60% Pas d’amplification

  33. Herceptest® (Dako) • Anticorps primaire polyclonal ( A0485) • Sur tissus fixés en FORMOL neutre tamponné • Réactifs prêts à l’emploi • Témoins : lignées cellulaires, nombre déterminé de copies HER2/neu • Système de lecture standardisée

  34. Comparaison Herceptest® / FISH Jacobs : J Clin Oncol, 1999, 17, 1974 - 82 Pauletti :J Clin Oncol, 2000, 18, 3651- 64 Lebeau : J Clin Oncol, 2001, 19, 354 - 63 Tubbs : J Clin Oncol, 2001, 19, 2714 -21 Perez : Mayo Clin Proc, 2002, 77, 148-154 Dowsett : J Pathol, 2003, 199, 418-423 Ainsworth : J Clin Path 2005, 58, 1086-1090 • positivité faible (++) : 6 à 87 % de faux positifs • positivité forte (+++) : 6 à 25 % de faux positifs Peut être une trop grande sensibilité mais la dernière version du kit donne de très bons résultats • dans le respect strict des conditions de fixation non alcoolique, • l’utilisation de témoins externes issus du laboratoire et dont le niveau d’amplification a été préalablement analysé • l’apprentissage de l’interprétation

  35. Recommandations pour calibrer l’IHC sur la FISH et maintenir la concordance entre les 2 techniques Arch Pathol Lab Med, 2003, 127, p 549Modern Path, 2003, 16, p 173Histopathology, 2003,42, p 337

  36. Conditions de fixation, préparation des coupes • Fixation optimale • en FORMOL neutre tamponné • moins d’1h après la résection chirurgicale • moins de 48h • fragment de 0.5 à 1cm d ’épaisseur • Préparation des blocs et coupes • conservation des blocs de paraffine à 20 à 25°C • réalisation des coupes idéalement moins d’une semaine avant à 20- 25°C • au maximum 4 à 6 semaines avant la technique d’immunohistochimie à condition d’un stockage à 4°C • 3 à 5µm d’épaisseur

  37. Calibration de la technique • Conditions de réaction calibrées sur • FISH • témoins • lignées cellulaires • pH du tampon de pré-traitement (pH : 6) • Choix de l’anticorps : monoclonal ou polyclonal • Dilution de l’anticorps primaire • CB11 : 1/500 à 1/800 • A0485 : 1/500 pour le formol • 1/400 pour l’AFA Adapter la dilution à chaque changement de technique, y compris entre deux automates identiques mais plus ou moins neufs (expérience de Claudius Regaud, Toulouse)

  38. Témoins • Utilisation de contrôles : • lignées cellulaires, fixées comme le tissu analysé • bloc multi-tissulaire (0, ++, +++) : nombre de copies connues par FISH • Bloc choisi avec tissu normal, en évitant le tissu décalcifié • Faux négatifs rares si pré-traitement par la chaleur

  39. Glandes normales : témoin interne négatif de réaction Augmenter la dilution de l’anticorps primaire si marquage des glandes normal

  40. Maladie de PAGET témoin positif de réaction Fort niveau d’amplification Surexpression forte +++

  41. Témoin (++) amplifié (témoin intermédiaire très utile) • À obtenir auprès d’un centre expert FISH • Sur un des cas du laboratoire (condition de fixation et préparation des blocs identiques aux cas à tester )

  42. Calibrage de l’immunohistochimieContrôle de qualité interne (1) • Pas de marquage des glandes normales • Coupe d’un bloc multi-tissulaire inclus à chaque manipulation : • forte amplification (forte surexpression) • amplification modérée (intensité modérée) • pas d’amplification (pas de marquage)

  43. Calibrage de l’immunohistochimiecontrôle de qualité interne (2) • Fréquence des cas positifs : 15 à 30% • Retester 5% des cas positifs et négatifs / an • CURIE en 2005: • 24 cas 3+: 100% concordance avec la FISH • 4 cas 8 copies HER2 • 18 cas > 10copies • 2 cas NI • 19 cas négatifs 100% concordance avec la FISH

  44. En cas de surexpression de HER2 sur la tumeur primaire Tumeur primaire Métastase HER2+++ bronchique médullaire

  45. HER2 et récepteurs hormonauxcorrélation inverse • Lal et al Am J Clin Pathol 2005 • Koneckny JNCI 2003 • Taucher et al Cancer 2003 • Huang et al, Annals of Oncology , 2005

  46. Calibrage de l’immunohistochimie contrôle de qualité externe : • Résultats à vérifier par FISH / CISH • Entraînement et formation du personnel • Tests nationaux (AFAQAP) 1 test / an européen (UK NEQAS) 4 tests / an

  47. Indications de la détermination du statut de HER2 • En 2007, idéalement : • au diagnostic initial de carcinome infiltrant (ASCP 2006) !! • Ou bien : • Patientes métastatiques • N+ • N- avec critères de prescription de chimiothérapie adjuvante et/ou d’hormonothérapie adjuvante

  48. En pratique • Regrouper les manipulations • Validation • vérification de la conformité des témoins externes, • détermination du niveau de l’intensité de la manipulation du jour ++++ • Interprétation des cas par le médecin ayant signé le diagnostic.

  49. Interprétations • Prendre en compte • Le marquage membranaire • Le % de cellules carcinomateuses infiltrantes • L’intensité du marquage • Pas de seuil validé sur la réponse au traitement

  50. Le score Score Marquage Indication Herceptin

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