Determinazione della concentrazione proteica mediante spettrofotometria

1. Determinazione della concentrazione proteica mediante spettrofotometria Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina Picco di assorbimento di Tirosine e Triptofani Assorbimento 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 Lunghezza d’onda “l” (nm)

2. Spettro di assorbimento UV-VIS di un RNA Abs260nm pari ad 1 corrisponde a 40 µg di RNA

3. SAGGIO DI ATTIVITA’ ENZIMATICA • SPECIFICO • QUANTITATIVO

4. SAGGIO KUNITZ • CARATTERISTICHE: • Il substrato è RNA di lievito 0,5 mg/ml • La reazione avviene ad un pH pari a 5 • Il saggio è condotto ad una temperatura di 25°C • La durata del saggio è di 1 minuto • La digestione dell’RNA provoca una diminuzione di Abs300 nm • Tale diminuzione è dovuta alla minore capacità di • assorbimento, a tale lunghezza d’onda, dei prodotti di • degradazione dell’RNA rispetto all’RNA non degradato.

5. Nel saggio Kunitz un’unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di determinare una variazione di Abs per minuto pari a ∆A1min/∆Atot, dove ∆Atot rappresenta la variazione di Abs rilevata in seguito a completa digestione del substrato. Il valore di ∆Atotviene determinato sperimentalmente.

6. RNasi A da pancreas bovino

7. Esempio di catalisi acido-base enzimatica Agiscono come catalizzatori generali acido-basici

8. His 12, fungendo da base, sottrae un protone da un gruppo 2’-OH dell’RNA, promuovendo così l’attacco nucleofilico sull’adiacente atomo di fosforo. L’His 119 svolge la funzione di acido e favorisce la scissione del legame protonando il gruppo uscente.

10. L’H2O entra nel sito attivo e l’intermedio 2’,3’-ciclico è idrolizzato attraverso un meccanismo che è essenzialmente l’inverso della prima tappa. L’His 12 ora agisce da acido generale e l’His 119 da base generale per l’RNA idrolizzato e l’enzima nel suo stato originale.

12. U di proteina di interesse nella frazione U di prot. di interesse presenti all’inizio della purificazione Resa= As U di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione =

13. Il SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE • La conoscenza della sequenza amminoacidica di una proteina costituisce il prerequisito • per la determinazione della sua struttura tridimensionale ed è essenziale per • comprenderne il suo meccanismo d’azione molecolare • I confronti tra le sequenze di proteine analoghe ottenute da specie differenti consentono • di approfondire le nostre conoscenze sulla funzione di queste proteine e svelano le • relazioni evolutive tra le proteine e gli organismi che le sintetizzano • Numerose malattie ereditarie sono causate da mutazioni che determinano una • sostituzione amminoacidica in una proteina → le analisi delle sequenze • amminoacidiche possono essere di ausilio nello sviluppo di test diagnostici e di terapie • efficaci La proteina da sequenziare deve essere scissa in frammenti sufficientemente brevi da poter essere sequenziati individualmente, poi, partendo dalla sequenza dei tratti sovrapposti, si ricostruisce la struttura primaria della proteina intatta

14. DEGRADAZIONE DI EDMAN H R O H R O Condizioni basiche N N NH C + N N S C NH 23 R' O H H S R' O TFA 100% anidro Condizioni blande acide in acqua O O R R N NH + 3 Analisi tramite HPLC N N NH S R' H O S Derivato tiazolinonico Derivato feniltioidantoina (PTH) (più stabile) conversione • Il reagente di Edman, fenilisotiocianato (PITC), reagisce con il gruppo amminico • N-terminale di un polipeptide in condizioni blandamente alcaline, per formare il • feniltiocarbamile (PTC) • Tale addotto è trattato con acido trifluoroacetico (F3CCOOH) anidro, che • libera il residuo N-terminale sotto forma di derivato tiazolinonico, senza • idrolizzare gli altri legami peptidici • Il derivato tiazolinone-amminoacido è estratto selettivamente con un solvente • organico ed è convertito nel più stabile derivato feniltioidantoina (PTH) mediante • trattamento con un acido in soluzione acquosa

15. Identificazione del PTH-aa N-terminale mediante cromatografia Il tipo di amminoacido è identificato con una cromatografia per mezzo di amminoacidi standard di riferimento Separazione dei 20 PTH-aa

16. Dopo circa 30 cicli diventa difficile determinare la sequenza amminoacidica. Ciò accade perché, dopo un numero elevato di cicli, gli effetti cumulativi di reazioni incomplete e di reazioni secondarie del processo di degradazione di Edman rendono impossibile una identificazione certa dell’amminoacido rilasciato e quindi della sequenza amminoacidica. Per tale motivo la proteina da sequenziare è scissa in piccoli frammenti polipeptidici. Una volta determinata la sequenza di ognuno di essi, si procede con la determinazione della sequenza della proteina completa mediante il principio della sovrapposizione dei peptidi.

17. Proteina di 150 aa Nter-----------K------K------R------------R---------K----------Cter Idrolisi con TRIPSINA,peptidasi dotata di elevata specificità: taglia i legami peptidici dal lato C (verso il terminale carbossilico) dei residui carichi positivamente Arg (R) e Lys (K), se il residuo successivo non è Pro Nter-----------Kcter 1° peptide Nter------Kcter 2° peptide Nter------Rcter 3° peptide Nter------------Rcter4° peptide Nter---------Kcter 5° peptide Nter----------Cter 6° peptide

18. Separazione dei PEPTIDI mediante cromatografia Determinazione della sequenza N-terminale di ciascun peptide 3 6 5 2 4 1 Nter-----------Kcter 1° peptide Nter------Kcter 2° peptide Nter------Rcter 3° peptide Nter------------Rcter4° peptide Nter---------Kcter 5° peptide Nter----------Cter 6° peptide

19. E’ necessario adoperare un metodo diverso per generare una • serie di frammenti peptidici differenti • Anche in questo caso si procederà alla determinazione della • sequenza N-terminale di ciascun peptide ottenuto • Le due serie di sequenze peptidiche sovrapposte consentono • di ricostruire la sequenza di ciascun polipeptide

20. I risultanti gruppi sulfidrilici liberi sono alchilati, di norma mediante trattamento con iodoacetato, per prevenire la riformazione dei ponti disolfurici attraverso ossidazione da parte di O2

21. Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly i. Determinazione della composizione in ammionoacidi • cromatografia a scambio ionico • eluzione in funzione del pH

22. CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO SEPARAZIONE DI AMMINOACIDI • Scambiatore cationico forte • pH 1-2 (tutti gli aa si legano) • Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica: • aa acidi (es. aspartato e glutammato) • aa neutri (es. glicina e valina) • aa basici (es. lisina e arginina) • Rivelazione tramite ninidrina

23. Identificazione del residuo amino terminale • marcatura con cloruro di dansile • idrolisi (a) Il composto fluorescente dansil cloruro reagisce con le ammine primarie formando polipeptidi dansilati. Il trattamento di un polipeptide dansilato con un acido in soluzione acquosa ad alta temperatura idrolizza i suoi legami peptidici ed il residuo N-terminale risulta così libero. Questo derivato può poi essere separato dagli altri amminoacidi per via cromatografica ed identificato grazie alla sua intensa fluorescenza gialla. degradazione di Edman: rimozione di un amminoacido alla volta dall’estremità NH2-terminale (b)

24. a-c  Ala c-e  Gly

25. Degradazione di Edman  Lunghezza massima  50 residui perdita di attendibilità Tagli specifici con metodi chimici o enzimatici Reagente Sito di taglio Taglio chimico Bromuro di cianogeno Lato carbossilico di residui Met O-iodobenzoato Lato carbossilico di residui Trp Idrossilammina Legami Asp-Gly 2-Nitro-5-tiocianobenzoato Lato aminico di residui di Cys Taglio enzimatico Tripsina Lato carbossilico di residui Lys e Arg Clostripaina Lato carbossilico di residui Arg Proteasi dello Stafilococco Lato carbossilico di residui Asn e Gln

26. Prima proteina sequenziata Sanger F., Tuppy H.(1951)“The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin 2.The investigation of peptides from enzymic hydrolysates.” Biochem. J. 49:481-490 Si dimostró che la sequenza era costituita solo da L-aminoacidi uniti tra loro da legami peptidici fra i gruppi a-amminici e i gruppi a-carbossilici