Determinazione della concentrazione di IgG tramite saggio immunoenzimatico competitivo

1. Determinazione della concentrazione di IgG tramite saggio immunoenzimatico competitivo COATING Preparare 10 mL di una soluzione di IgG di rabbit 1g/mL in tampone carbonato 0.05M pH 9.6 (soluzione A) a partire da una soluzione di un 1mg/mL. Addizionare 200L della soluzione A in ciascun pozzetto e lasciare incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT); Preparare 250 mL di PBS + TWEEN 0.05%. Effettuare 3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%. BLOCCAGGIO Preparare 5 ml di BSA 5% in carbonato Addizionare nei pozzetti 200L di una soluzione al 5% di BSA in tampone carbonato (1h RT); 3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%. COMPETIZIONE Preparare, per diluizioni successive, 1 ml di 5 soluzioni standard di IgG (in PBS): 100, 10, 1, 0.1, 0.01 g/mL. Preparare 5 mL di una soluzione di Mab-AP 1:1000 (v/v). Successivamente, preparare 10 mL di una soluzione 1:10000 (v/v) per diluizione 1:10 (v/v) della soluzione di Mab-AP precedente. Secondo lo schema riportato in figura, addizionare in ogni pozzetto 100L di IgG di rabbit alle concentrazioni sopra indicate e 100L di MAb-AP (1:10000 in PBS) . Porre nei pozzetti 7A, 7B, 7C, al posto dello standard, 100L del campione incognito. * nei 3 pozzetti (1A,1B,1C) di non competizione porre 100 L di MAb-AP + 100 L di PBS. Incubare 1h a RT. 3 lavaggi con 200L di PBS + TWEEN 0.05%.

2. 0* 0.01 0.1 1 10 100 ? 0* 0.01 0.1 1 10 100 ? LETTURA Preparare 50 mL di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone Carbonato 0.05M pH= 9.6 + MgCl2 1mM Porre in ogni pozzetto 200L di una soluzione di 4-nitrofenilfosfato (11 mM) preparata in tampone Carbonato 0.05M pH= 9.6 + MgCl2 1mM Eseguire la lettura della piastra a 405 nm dopo 5, 10, 15 min. ELABORAZIONE DATI Riportare in grafico le assorbanze lette a 405nm in funzione delle concentrazioni utilizzate; dalla curva ottenuta ricavare la concentrazione del campione incognito. 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 A A ? B B ? C C ?