CURSO FISIOLOGÍA GENERAL MANTENCIÓN DE LOS GRADIENTES IONICOS Daniel Wolff 2008

1. CURSO FISIOLOGÍA GENERAL MANTENCIÓN DE LOS GRADIENTES IONICOS Daniel Wolff 2008

2. TRANSPORTE ACTIVO

3. TRANSPORTE ACTIVO Introducción. Origen del concepto: fue creado por Rosenberg y Ussing (1948, 1949) para explicar dos procesos fisiológicos que se dan a distinto nivel: a.- Regulación del medio interno (homeostasis iónica) en animales acuáticos. Los anfibios y peces de agua dulce viven en un medio hipotónico. Están constantemente perdiendo sales y ganando agua. Por lo tanto, poseen mecanismos activos para captar sales a través de las branquias o la piel. Los peces de agua de mar se ven enfrentados a una situación opuesta. Están constantemente enfrentados a la pérdida de agua y entrada de sales a través de la piel, branquias, intestino, etc. Para compensar la pérdida de agua deben extruir activamente sales. Este proceso requiere energía.

4. V TRANSPORTE ACTIVO b.- La homeostasis iónica en las células de eucariontes y procariontes. Las células mantienen una asimetría iónica entre el interior y el exterior y una diferencia de potencial eléctrico a través de la membrana celular. La concentración de K+ es más alta en el interior y lo contrario ocurre con el ión Na+. Se ha determinado que al inhibir el metabolismo las células pierden K+, ganan Na+ y agua. Esto sugiere la existencia en las células mecanismos para mantener activamente estos gradientes de concentración y de potencial eléctrico: transporte activo. Ca2+ = 0,1 μM Ca2+ = 1 mM Na+ K+

5. Aspectos Termodinámicos del Transporte Activo. Definición: existe transporte activo de un soluto S (i.e. ión) si este se mueve en contra de su gradiente de potencial electroquímico, i,y su transporte está acoplado a reacciones bioquímicas celulares. Si hay dos compartimentos 1 y 2 que contienen un soluto S (ej. un ión). S (1)  S (2) El potencial electroquímico de un ión i está dado por la siguiente expresión: i = 0 + RTln Ci + zF Si : i(1)i(2) , entonces : 0 + RTln Ci(1) + zF1 < 0 + RTln Ci(2) + zF2 i = i(2) - i(1) El transporte activo implica un aumento en el potencial químico i del soluto transportado. y el cambio de energía libre del proceso es entonces  0: G(ti ) = RT ln[Ci(2)/ Ci(1)]+ zF(1 -2)  0

6. Los procesos espontáneos ocurren en el sentido de una disminución de la energía libre G, o sea que G < 0. Dado que i(1)I(2), entonces G(ti )  0; esto significa que el proceso no es espontáneo. Para que el proceso de transporte activo ocurra, éste debe estar acoplado a un proceso bioquímico cuyoG < 0,de modo que la suma: nG(ti) + G(qi)  0 n = coeficiente estequiométrico (moles de soluto transportado /moles de sustrato consumidos). Para realizar el transporte activo de los iones las células poseen mecanismos moleculares que lo impulsen: bombas de iones. Si la célula fuera un sistema cerrado se llegaría a un equilibrio en que se cumpliría : nG(ti ) + G(qi ) = 0 Sin embargo…….………….. transporte pasivo transporte activo

7. Sustrato Producto Modelo de bomba y fuga …… las células son sistemas termodinámicos abiertos, es decir que intercambian materia y energía con el medio: en la práctica no se llega a un equilibrio por que los gradientes iónicos creados por las bombas tienden a disiparse continuamente a través de vías de fuga o “leaks”. Por lo tanto, para mantener estos gradientes la célula debe consumir continuamente energía que proviene principalmente de reacciones bioquímicas muy exergónicas. Modelo de bomba y fuga

8. Ejemplo a.- Calcule la energía libre, G(tNa), necesaria para remover 5 pmoles (5 x 10-12 moles) de Na+ desde el interior de una célula nerviosa de calamar. Las concentraciones externas e internas de Na+ son 430 y 40 mM respectivamente, y el potencial de reposo de la fibra  = (i - e) = -60 mV a 20 oC. G(ti ) = RT ln [Ce/Ci] + zF(e - i) R = 8,31 J mol-1oK-1, F = 96.500 C mol-1, T = 293 oK G(tNa) = RT ln([Na+]e/ [Na+]i) + zF(e -i) G(tNa) = 8,31 J mol-1oK-1 x 293 oK x ln(430 x 10-3/40 x 10-3) + 96,5 x 103 C mol-1 x 60 x 10-3 V G(tNa) = [8,31 x 293 x 2,375] + [96,5 x 103 x 60 x 10-3] J/mol G(tNa ) =[ 5.783 + 5.790] J/mol =11.573 J/mol G(tNa ) = 11.573 J/mol x 5 x 10-12 mol = 5.7865 x 10-8 J b.- ¿Cuál sería el valor de G(tNa), si el potencial de membrana fuera +60 mV? G(tNa) = 8,31 J mol-1oK-1 x 293 oK x ln(440 x 10-3/40 x 10-3)– 96,5 x 102 C mol-1 x 60 x 10-3 V G(tNa) = [8,31 x 293 x 2,375] J/mol- [96,5 x 103 x 60 x 10-3] J/mol G(tNa) = 5.783 – 5.790 = ~0 J/mol

9. Criterios de Transporte Activo a) H. Ussing introdujo la medición de la razón (f )de flujos unidireccionales(*) de un soluto x :  Jie Ci f =  = exp zF/RT  Jei Ce [*: los flujos unidireccionales (moles/s cm2)pueden medirse con radioisótopos de los solutos, siempre que se conozca la actividad específica (cpm/mol) ] b) Generación de un gradiente de concentración del soluto transportado debido al funcionamiento del sistema de transporte activo. Sistemas de transporte activo Sistemas de transporte activo primario: Son aquellos en los que la energía para el proceso proviene directamente de una reacción bioquímica como la hidrólisis de un compuesto cuyo ΔG(qi) < 0. Ejemplos de estos sistemas son el transporte activo acoplado de Na+ y K+ y de transporte activo de Ca2+ en células de eucariontes. Sistemas de transporte activo secundario: En éstos la fuente de energía para el transporte activo es el gradiente de potencial electroquímico generado por un soluto que se transporta por transporte activo primario. Ejemplos : transporte activo de azúcares y aminoácidos acoplado al transporte de Na+ en intestino delgado y la extrusión de Ca2+ en intercambio con Na+ en neuronas y células musculares.

10. Transporte activo primario Transporte activo acoplado de Na+ y K+ en células animales. Uno de los sistemas más utilizados para estudiar el transporte activo primario ha sido los glóbulos rojos humanos. Son células aisladas, abundantes (aprox. 5 millones por mm3de sangre), fáciles obtener y son homogéneos. Tienen la desventaja de que poseen pocos sitios de T.A.

11. Concentraciones de iones en el plasma y en GRs humanos [mM]: K+ Na+ Cl- HCO3- ECl EK ENa  [mV] Plasma 5,4 144 111 28 Célula 150 20 75 20 -9,9 -84,0 +43,1 -9,0 Como puede observarse, en los glóbulos rojos los cationes no están en equilibrio termodinámico, pero si lo están los aniones : [Cli-]/[Cle-] = [OHi-]/[OHe-] = [HCOi3-]/[HCOe3-]

12. Acoplamiento de los flujos de Na+ y K+ en eritrocitos. En 1941 Harris y Danowski y luego Harris y Maizels en 1952 estudiaron la extrusión de Na+ y la acumulación de K+. Observaron que: 1.- eritrocitos mantenidos a 2 - 5 oC ganaban Na+ y perdían K+. 2.- a 37 oC en presencia de glucosa extruían Na+ y reacumulaban K+ (Figura). 3.- la velocidad de extrusión de Na+ era función de la [Nai+] …y ……!!de la [Ke+]!!. Este resultado constituía una fuerte evidencia del acoplamiento entre estos dos procesos.

13. Acoplamiento de los flujos de Na+ y K+ en eritrocitos. Glynn en los 1960`s mostró que el flujo de entrada de K+ sigue una cinética compleja que puede interpretarse compuesta de dos mecanismos separados: uno lineal difusivo y otro saturante y dependiente del metabolismo partially Glucose absent El estudio del transporte activo de Na+ y K+ avanzó notablemente con : a) el hallazgo por Schatzmann (1956) que drogas cardiotónicas como estrofantidina y ouabaína (glicósidos cardíacos) inhibían específicamente el T.A. de Na+ y K+, sin interferir con la glicólisis. b) el desarrollo por Hoffman de la preparación de fantasmas de eritrocitos. c) el uso de los radioisótopos 40K+ y 22Na+ para medir flujos de estos iones.

14. Inhibidores de sistemas de transporte

15. Garrahan y Glynn, y Sachs y Welt (1967) estudiaron el acoplamiento de los flujos activos de Na+ y K+. Preincubaron células con 22Na+ y los suspendieron en medios con diferentes [Ke+]. Midieron la salida activa de Na+ en función de la concentración externa de K+ : [Na+i](t) = [Na+i](0) exp(-kNa t). También encontraron que la constante de velocidad de la salida activa de Na+,kNa, era una función sigmoídea de la [Ke+] 20 mM-K

16. Por otra parte, la captación activa de K+ seguía una cinética de saturación en función de [Ke+] Estequiometría de la bomba. Post y Jolly (1957) midieron la velocidad de extrusión de Na+ de eritrocitos humanos cargados de cantidades variables de este ión, en función de la concentración de K+ externo. Demostraron que al graficar el incremento de [K+i] versus la disminución de [Na+i]los puntos experimentales caían en una línea cuya pendiente era 2/3: indicando una acumulación de 2 K+ por la extrusión de 3 Na+

17. ATP Fuente de energía para el transporte activo de Na+ y K+. En 1954 Gárdos demostró en GRs resellados que la acumulación de K+ era dependiente de ATP (interno) que se hidrolizaba en el proceso. En 1955 Hodgkin y Keynes observaron que al tratar axones gigantes de calamar con DNP 0.2 M o CN- (Caldwell y cols. 1960) se inhibía el flujo de salida de 24Na+. Al perfundir la fibra con arginina fosfato o ATP se observaba un incremento en la extrusión de Na+

18. Estequiometría de la bomba Se demostró que la estequiometría total de la bomba es: 3 Nai+ : 2 Ke+ : 1ATP. 3Nai+ + 2 Ke+ + ATPi + H2O 3 Nae+ + 2 Ki+ + ADPi+ Pi Gtotal = 3 GNa + 2 GK + 1 GATP < 0 El número de sitios para Na+ se puede determinar midiendo los flujos activos de este catión en función de su concentración interna: Jmax [Nai+]n JNa+ = KNa + [Nai+]n De esta relación se determinó que el número de sitios para la bomba de Nai+ era n = 3.

19. Mg2+, Na+ y K+ Microsomas + ATP ADP + Pi Bioquímica del transporte activo de Na+ y K+. En 1958 J.C. Skou obtuvo una preparación de vesículas de membrana de nervio de patas de cangrejo que presentaba actividad ATPásica, requería Mg2+, Na+ y K+ y era inhibida específicamente por ouabaína.

20. Mg2+, Na+ y K+ Microsomas + ATP ADP + Pi Lo que medía Skou era la producción de fosfato inorgánico Skou: obtuvo el Premio Nobel en 1997 por sus trabajos en la Na/K ATPasa Skou: Dependencia de la actividad de la Na/K ATPasa de la concentración de Na+ y K+ (a) μg Pi

21. Ciclo catalítico de la Na+-K+ ATPasa Skou, Post, Albers y otros investigadores (1960s-1970s) demostraron en una serie elegantes experimentos que la reacción de la Na+-K+ ATPasa  ocurre en varias etapas : 1.- Transferencia del fosfato terminal del ATP a un residuo aspartato de la enzima. Esta fosforilación requiere de la presencia de Na+ y Mg2+. 2.- La enzima fosforilada sufre un cambio conformacional (E1-E2). Paso inhibido por oligomicina y NEM agente modificador de grupos sulfhidrilos. 3.- La enzima se desfosforila liberándose Pi. Se requiere la presencia de K+ y Mg2+ y es inhibida por ouabaína. 4.- La enzima pasa de E2 - E1 Esquema de reacciónMg2+ Mg2+ 3Nai++ E1 E1(Nai+)3+ ATP E1(Nai+)3ATP E1(Nai+)3P + ADP Mg2+Ke+ E1(Nai+)3P E2(Nai+)3P E2 + 3Nae+ + Pi + 2Ki+ E2 E1

22. Mecanismo del transporte activo de Na+ y K+: 1.- durante los cambios conformacionales la proteína expone alternadamente sitios de unión de estos iones a uno y otro lado de la membrana (análogo a los transportadores). 2.- tres iones Na+ se unen con alta afinidad a sitios en el lado citoplasmático de la proteína. 3.- se une ATP (complejado con Mg2+) al sitio de fosforilación. 4.- El ATP se hidroliza a ADP y el grupo fosfato es transferido a un grupo aspartato de la enzima (E1-P). La fosforilación activada por Na+ le da a la enzima una conformación “ocluida” : los iones Na+ quedan “encerrados” en la proteína. 5.- la ATPasa sufre un cambio conformacional desde (E1-P) al estado (E2-P), más estable. 6.- los iones Na+son transportados a través de la proteína hasta ligarse débilmente a sitios que se forman en el lado externo de la membrana y se liberan al exterior. 7.- la forma E2-P de la enzima es de baja energía y la unión del dos iones K+ a sitios externos de la proteína acelera su desfosforilación. 8.- los iones K+ pasan a través de la proteína y son liberados al medio citoplasmático Por formar un intermediario fosforilado a esta enzima se le ha clasificado dentro de las ATPasas de membrana tipo P.

23. K+ release (intracellular) Esquema del ciclo de transporte de Na+ y K+ por la bomba de sodio Lodish et al. 2004

24. Evidencias de identidad entre la bomba de Nay la Na+-K+ ATPasa 1.- ambas funciones se encuentran en las membranas plasmáticas 2.- se requiere de la presencia simultánea de Na+ y K+ para inducir el transporte activo y la hidrólisis de ATP. 3.- a [Na+] saturantes, la [K+] necesaria para obtener ½ de Vmáx (Pi) es la misma que para obtener ½ JK+máx,, o sea: Kmbomba = KmATPasa. 4.- ambas funciones son inhibidas por ouabaína en el mismo rango de concentración. 5.- la actividad de transporte activo de Na+ y K+ puede ser reconstituida incorporando la proteína Na+-K+ ATPasa purificada en liposomas.

25. Estructura química de la bomba de Na En los 1970´s se desarrollaron métodos para solubilizar y purificar proteínas integrales de membrana usando detergentes (i.e. Triton X-100). La bomba de Na fue una de las primeras proteínas de membrana en ser purificada y ha sido aislada de médula renal, cerebro, órgano eléctrico de anguila, etc. Sitios de bomba en diferentes tipos de células:  en eritrocitos humanos hay 1 sitio/m2, en riñón 102, en cerebro 103 y en el órgano eléctrico de Torpedo 104. .

26. Estructura química de la bomba de Na La enzima ha sido disociada en dos subunidades:, de 110 kDa (1000 AA) y un glicopéptido, , más pequeño de alrededor de 55 kDa. La subunidadcontiene el residuo aspartil fosforilable y el sitio de unión a oaubaína las funciones catalíticas están en la subunidad . La estructura primaria de las subunidades  y fue deducida a partir de las secuencia de cDNA de células de órgano eléctrico de Torpedo (Numa, 1986).

27. Perfiles de Hidropatía Alberts et al. 2002 Los segmentos de la cadena polipeptídica que potencialmente pueden tener una estructura de hélice  pueden ser identificados mediante los diagramas de hidropatía. La energía libre (ΔG) requerida para transferir segmentos sucesivos (aprox. 10 AA) de la cadena desde un solvente no polar al agua se calcula de la composición aminoacídica de cada segmento.

28. Estructura química de la bomba de sodio dominio A rizo central (dominios P y N) Sitio de fosforilación As369  Subunit Sitios de glicosilación A partir de los perfiles de hidropatía se han deducido 10 segmentos de trasmembrana para la subunidad  de la Na+-K+ ATPasa.

29. Estructura de la bomba de sodio La cadenaposee 10 segmentos de transmembrana unidos por 5 cortas asas extracelulares (análogo a otras ATPasas tipo P) y está muy conservada. La fosforilación ocurre en un residuo Asp (369 en humano y 376 en electroplax) en un bolsillo de 7 AA que contiene la secuencia AspLisTreGliTre (presente en todas las ATPasas tipo P), 30 residuos del término de M4. Hay un gran rizo (loop) central entre M4 y M5 (430 AA), una larga cola N terminal (90 AA) y un lazo intracellular de 120 AA entre M2 y M3. Estos forman diferentes dominios: N, P y A. Los dominios N (unión a nucleótido) y P (de fosforilación) están formados por el rizo M4M5 y el dominio Ao “activador”, está formado por el asa M2M3 y la cola N terminal. extracelular citosol

30. Estructura de la bomba de sodio La subunidad tiene un solo segmento transmembrana. Está compuesta de 370 AA y expone la mayor parte de su estructura muy plegada al exterior (300 AA). Su función aún no se conoce pero se piensa que se requiere para el adecuado plegamiento de la proteína y su destinación a la MP. Se supone que la unión de las dos subunidades ocurre en el RE. La enzima funcional parece estar formada por dímeros de . Se ha demostrado la existencia de 4 isoformas de las sub unidades ,(1,2, 3 ,4) y 4 de la ,(1, 2, 3, 4). Estas isoformas difieren en su afinidad por la ouabaína, Km : 10-4 - 10-7 M.

31. K+ release (intracellular) Esquema del ciclo de transporte de Na+ y K+ por la bomba de sodio Lodish et al. 2004

32. Funciones de la bomba de Na. El transporte acoplado de Na+ y K+ aparece hace como 600 x 106 años. Esta bomba tiene un rol fundamental en las células animales en diversas funciones : 1.- Es responsable de la asimetría en las concentraciones intra y extracelulares de Na+ y K+. 2.- Varias enzimas del metabolismo intermediario y de la síntesis de proteínas requieren altas concentraciones de K+ para su actividad óptima; varias son inhibidas por alta [Nai+]. 3.- Estas asimetrías iónicas son responsables de la mantención de la diferencia de potencial eléctrico (de reposo) a través de la membrana celular y de los fenómenos bioeléctricos esenciales en la función de las células excitables como nervio y músculo. 4.- La asimetría en [Nai+] y [Nae+] establecida por la bomba energetiza el transporte activo secundario de diferentes solutos: i.e. cotransporte glucosa/Na+ y aminoácidos/Na+ en intestino, y el intercambio Na+/Ca2+ en nervio y músculo. 5.- Otra función vital de la bomba de Na en células animales es mantener la osmolaridad intracelular equilibrada con la exterior lo que hace que se mantenga regulado el volumen celular.

33. Bombas de Ca o Ca2+-ATPasas Las bombas de Ca o Ca2+-ATPasas también pertenecen grupo de ATPasas de membrana tipo P. Están presentes en la MP y en organelos como retículo endoplásmico y sarcoplásmico (SERCA) y el aparato de Golgi. Juegan un papel importante en la homeostasis celular de este ion. Las SERCAs están constituidas por una sola cadena polipeptídica de 110 kDa. En cada ciclo catalítico se transportan 2 iones Ca2+ por cada ATP hidrolizado e intercambian 2H+ por 2 Ca2+. La Ca2+-ATPasa de MP tiene una estequiometría de 1:1 respecto al ATP e intercambia 1H+ por 1Ca2+.

34. Esquema de reacción: El modelo más aceptado del mecanismo catalítico de estas Ca-ATPasas es el siguiente : Mg2+ 2Cai2+ + E1 E1(Cai2+)2+ ATP E1(Cai2+)2ATP E1(Cai2+)2 P + ADP E1(Cai2+)2P E2(Cae2+)2P E2 P+ 2Cae2+ E2 P Pi + E2 E1

35. Determinación de los parámetros cinéticos en la bomba de Ca2+ de A. de Golgi y RE Rojas P., Surroca. A., Orellana A. & Wolff, D,2000

36. lisina Dominio citoplasmático de unión a ATP CITOSOL aspartato (351) del sitio catalítico de unión a ATP Corta cola carboxi terminal dominio de hoja  Tallos dominios hélices  Dominios hélices  transmembrana unión a TG Topología de la bomba de Ca2+ tipo SERCA con sus dominios funcionales más importantes

37. Estructura de la bomba de Ca2+ tipo SERCA N citosol A P citosol membrane lumen unión deTG

38. Sitios de coordinación de iones Ca2+ de la Ca2+-ATPasa. Vista desde el lumen del RE. Los dos iones Ca2+ (verde) están coordinados por Val304, Ala305, Ile307 and Glu309 (M4), Asn768 and Glu771 (M5), Thr799 y Asp 800 (M6), and Glu908 (M8). El grupo carboxilo de la cadena lateral de Asp 800 participa en la coordinación de ambos iones Ca2+.

39. Transporte de iones Ca2+ en la bomba de calcio SERCA Alberts et al. 2000

40. ATPasas de membrana tipo V. Están presentes en las membranas de las vacuolas y en organelos como lisosomas, retículo endoplásmico, cisternas del aparato de Golgi y vesículas cubiertas, bombean electrogénicamente H+ desde el citosol al lumen del organelo. Tienen una estructura constituida por un dominio hidrofóbico ubicado en la membrana (V0) que constituye la vía de transporte de protones y una cabeza (V1) hidrofílica que está orientada hacia el citoplasma y donde se realiza la hidrólisis del ATP. H+ lumen V0 citosol H+ V1

41. H+ ATPasas de membrana tipo V. La forman siete tipos de subunidades diferentes con un PM total de entre 400 y 500 kDa. Los procesos de transporte de H+ e hidrólisis de ATP están separados y durante el ciclo de transporte no se fosforilan. Múltiples genes podrían codificar isoformas con propiedades específicas requeridas para servir las diferentes funciones de vacuolas y endomembranas. H+

42. H+ H+ e- H+ FADH2 H+ H+ H+ ATPasas de membrana tipo F Están presentes en las membranas plasmáticas de las bacterias, en la membrana tilacoide de cloroplastos y en la membrana interna de las mitocondrias. Catalizan la reacción de síntesis de ATP (G > 0) a partir de ADP y Pi: Síntesis quimiosmótica de ATP. La energía proviene del gradiente de potencial electroquímico de protones (fuerza proton motriz) a través de la membrana generado por la actividad de la cadena transportadora de electrones (cadena respiratoria): es decir, actúan como ATP sintetasas. H+ H+ H+ Inner membrane e-

43. H+ ATPasas de membrana tipo F Al igual que las ATPasas tipo V están formadas por dos dominios : F1 y F0 El complejo integral F0 contiene tres tipos de subunidades a, b y c. En bacterias éstas tienen composición a1b2c10 y contiene el canal a través del que se transportan los protones. El complejo F1 está compuesto de 5 polipéptidos diferentes : , , ,  y , con estequiometría 3,3, . H+ H+

44. Fuerza Protón Motriz H+ (i) i = citosol o matriz  H+ (e)e = extracelular El potencial electroquímico del H+ en un compartimento está dado por la siguiente expresión:   H+ = 0 + RTln CH++ zF Si : H+(i)H+(e) , entonces : 0 + RTln CH+(i) + Fi<0 + RTln CH+(e) + Fe H+ =H+(e) - H+(i) H+= RT ln CH+(e)/ CH+(i) - F(e -i)  =(i -e) = Vm H+ = RT 2.3 log (CH+(e)/ CH+(i))+ F(i -e) = RT 2.3(-pH) + F FPM = H+ /F =  - RT/F 2.3(pH)  

45. Transporte activo secundario En este caso la fuente de energía para el transporte activo es el gradiente de potencial electroquímico de un soluto que se transporta por transporte activo primario. Ejemplos: 1.- cotransporte de azúcares y aminoácidos en intestino. 2.- intercambio de sodio y calcio en células excitables.

46. 1.- Transporte activo de azúcares y aminoácidos acoplado al transporte de Na+ en intestino delgado. En el epitelio intestinal, las células que realizan el transporte activo de estos solutos son los enterocitos Estudios in vivo Los primeros estudios del transporte de azúcares se realizaron in vivo. Cori y Willbrandt en 1926 y Barany y Sperber (1936) midieron las velocidades relativas de absorción de monosacáridos en intestino delgado Azúcar % control CN- D-galactosa 115 53 D-glucosa 100 33 D-fructosa 44 37 D-manosa 33 25 D-xilosa 30 31 L-glucosa 30 30

47. Na+ = 0 Na+ = 24 mM Na+ = 48 Na+ = 145 Wilson y Wiseman (1954) desarrollaron el sistema in vitro del saco intestinal evertido. Midieron la acumulación de azúcares en el interior de este saco y encontraron que : 1.- la glucosa se acumulaba en el saco, o sea se transportaba activamente. 2.- el transporte activo de glucosa era dependiente de la [Na+] en el lado mucoso del epitelio. 3.- el Na+ disminuye la Km pero no altera la Vmáx: actuaba como un activador competitivo. 1/Vmax

48. 4.- el transporte activo era inhibido por inhibidores metabólicos (CN-), por floridzina, baja temperatura y ouabaína desde el lado seroso. 5.- se determinó que existían dos vías de transporte para azúcares: dependiente y independiente de Na+. 6.- la entrada dependiente de Na+ requería que el azúcar tuviera estructura piranósica y el -OH del carbono 2 en posición ecuatorial. 1 2 Floridzina Ouabaína

49. En 1962, Crane formuló un modelo para el transporte activo de glucosa en los enterocitos. Schultz y Zalusky hicieron uno análogo para la absorción de aminoácidos. El modelo postula que los AAs y azúcares entran al enterocito a través de la membrana apical (borde en cepillo) mediante un cotransporte con Na+, acumulándose en el interior de la célula. La energía para el transporte en contra del gradiente de concentración provendría del gradiente electroquímico del ión Na+. Este gradiente se mantiene por la acción de bombas de Na+ presentes sólo en la membrana basolateral. Los azúcares salen de la célula hacia el plasma a través de esa membrana por transporte facilitado, vía transportadores específicos. bomba de Na gradiente μNa -50 mV

50. Para validar este modelo se debe demostrar que el gradiente de potencial electroquímico del Na+ es suficiente para energetizar el transporte activo de azúcares y aminoácidos. Se estima que la fuerza sodio-motriz (μNa/F)a través de la membrana es de  -120 mV. Se debe cumplir que : nGNa + mGG 0, [Gi] [Nae+] n o sea: ln < [ln - zF/RT]( ) [Ge] [Nai+] m El mecanismo de transporte de azúcares y aminoácidos se clarificó aún más cuando se hicieron estudios de captación de estos compuestos en vesículas de membranas apical (BB) y basolateral. Hopfer (1973). Midieron la captación rápida de azúcares marcados con 14C o 3H en presencia de gradientes de concentración de Na+ o por intercambio isotópico en equilibrio, en que se mide el intercambio de glucosa 3H cis/trans. Se confirmó que los cotransportadores azúcar-Na+ se encontraban sólo en las membranas del BB. El transporte muestra una cinética de saturación y parece haber 2 sistemas con diferente afinidad y capacidad. Las bombas de sodio solo se encuentran en la membrana basolateral