FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI

1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea Magistrale in Biologia Cellulare ELABORATO FINALE Analisi biochimica di Ferroportina umana ricombinante mediante incorporazione di amminoacidi non naturali Candidata: Mara Forino Relatrice: Dott.ssa Maria Carmela Bonaccorsi Dipartimento di Biochimica “A. Rossi Fanelli” Anno Accademico2013 – 2014

2. IL FERRO Uno dei metalli più abbondanti Reazioni biologiche che necessitano di ferro: la respirazionemitocondriale , la proliferazione cellulare e la sintesi di proteine come l’emoglobina e la mioglobina Capacità di interconversione ossidoriduttiva tra la forma ferrosa (Fe2+ )e la forma ferrica (Fe3+ ) Utile nelle reazioni enzimatiche

3. IL FERRO -ossidazione delle proteine -perossidazione dei lipidi di membrana -modificazione degli acidi nucleici Potenzialmentetossico: Reazioni di Haber-Weiss-Fenton: Le cellule si difendono: • mediante l’azione di enzimi, quali la superossido dismutasi e la catalasi, e di altri composti antiossidanti • mediante la regolazione del metabolismo del ferro

4. METABOLISMO DEL FERRO 3 siti fondamentali del corpo: • L’intestino, a livello del quale avviene l’assorbimento del ferro dalla dieta; • I macrofagi del sistema reticolo-endoteliale che riciclano il ferro dall’emoglobina dei globuli rossi senescenti fagocitati; • Il fegato che è il principale organo di accumulo del ferro e di gestione della sua distribuzione al corpo. L’assorbimento del ferro nel duodeno prevede: • la riduzione del Fe3+ a Fe2+, • l’uptake apicale del metallo da parte degli enterociti che lo riversano nella circolazione portale attraverso la membrana basolaterale.

5. LA FERROPORTINA umana • Proteina di membrana ( 60 KDa ) • Esportatore di ferro • Struttura e meccanismo d’azione non sono noti • Presente in diversi tessuti: • Enterociti duodenali • Macrofagi • Epatociti • Cellule della placenta ~ Il gene SLC40A1 La proteina è ben conservata nel pesce zebra (Danio rerio), in Arabidopsisthalianae Caenorhabditiselegans

6. LA FERROPORTINA umana Epcidina, peptide epatico, regolatore negativo dell’esporto del ferro MODELLO TOPOLOGICO 12 eliche Trans Membrana Estremità N-e C-terminali intracellulari

7. LA FERROPORTINA umana Modello Strutturale OUT Major Facilitator Superfamily Residui lato intracellulare IN Fpn conformazione inward open (Bonaccorsi di Patti et al., 2014).

8. ESPANSIONE DEL CODICE GENETICO: L’USO DI AMMINOACIDI NON NATURALI aaRS/tRNA endogeno aaRS/tRNA ortogonale -U-A-G-

9. SCOPO DELLA TESI Studio preliminare per ottenere nuove informazioni sulle caratteristiche strutturali della Ferroportina umana utilizzando la tecnica dell’incorporazione degli amminoacidi non naturali Lievito Pichiapastoris amminoacidi non naturali : p-acetil-fenilalaninap-benzil-fenilalanina (apa) (bpa)

10. SCOPO DELLA TESI Il lavoro si divide in più parti: • Costruzione del ceppo di Pichiapastoris JC300 che esprime le aaRS e tRNA ortogonali • Inserimento del plasmide con il cDNA di Ferroportina mutato con il codone TAG a livello del residuo Tyr331 • Espressione e purificazione della Ferroportina umana modificata • Analisi spettroscopiche

11. Costruzione del ceppo di Pichiapastoris JC300 che esprime le aaRS e tRNA ortogonali • JC300 (controllo negativo) • JC300-ApaRS #1 JC300-ApaRS #2 Marker PM Induzione di 6 giorni con metanolo 1%

12. B. Inserimento del plasmide con il cDNA di Ferroportina mutato con il codone TAG a livello del residuo Tyr331 residuo Y331: è presente in un loop extracellulare hFPN-flag

13. B. Inserimento del plasmide con il cDNA di Ferroportina mutato con il codone TAG a livello del residuo Tyr331 Doppio mutante Y54W-Y331* OUT OUT IN IN Outward-open Inward-open Studiare i movimenti di apertura/chiusura del trasportatore rispetto ai due versanti cellulari

14. B. Inserimento del plasmide con il cDNA di Ferroportina mutato con il codone TAG a livello del residuo Tyr331 Induzione di 6 giorni con metanolo 1% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

15. B. Inserimento del plasmide con il cDNA di Ferroportina mutato con il codone TAG a livello del residuo Tyr331

16. C. Espressione e purificazione della Ferroportina umana modificata Fpn modificata prodotta su larga scala ( 500ml per mutante) Purificazione tramite cromatografia di affinità : anticorpo monoclonale anti-flagcovalentemente legato ad una matrice di agarosio

17. D. Analisi spettroscopiche

18. RIASSUMENDO : • Costruzione del ceppo di Pichiapastoris JC300 esprimente le aaRS e tRNA ortogonali per incorporare gli amminoacidi non naturali para-acetilfenilalanina e la para-benzilfenilalanina; • La Ferroportina mutata con il codone di stop nella posizione Tyr331 viene espressa in presenza dell’amminoacido non naturale • Le analisi spettroscopiche UV-vis rivelano la presenza della proteina nei vari campioni analizzati con una resa massima nel caso del singolo mutante Fpn Y331apa di 0,89 mg per 500 ml di coltura. • Le analisi di spettroscopia CD mostrano che i vari mutanti Fpn sono ripiegati e sembrano avere una struttura con predominanza di α-elica, ma presentano delle differenze dovute probabilmente alla presenza dell’amminoacido non naturale

19. CONCLUSIONI Si può affermare che la tecnica di incorporazione di amminoacidi non naturali è una metodica innovativa che permette di generare proteine con nuove proprietà, ma sicuramente l’efficienza del metodo dipende sia dalle caratteristiche dell’amminoacido non naturale da incorporare, che dalla sua posizione nella struttura proteica.