IL DNA CLONATO PUO’ VENIRE ESPRESSO IN CELLULE BATTERICHE O EUCARIOTICHE

1. IL DNA CLONATO PUO’ VENIRE ESPRESSO IN CELLULE BATTERICHE O EUCARIOTICHE promotore cDNA ATG stop PA trascrizione proteina Caratterizzazione funzionale Produzione/ Purificazione

2. cDNA MCS P Promotore regolabile (inducibile, ad es. lac) cDNA MCS P

3. Espressione di proteine ricombinanti BATTERI: • Trasformazione • Induzione della trascrizione • Produzione proteina ricombinante • Purificazione CELLULE EUCARIOTICHE: • Trasfezione stabile o transiente, oppure infezione con vettori virali • Induzione • Produzione e purificazione • Analisi funzionale

4. Expression Tag, contenente il sito di inizio della traduzione e una parte della sequenza codificante per una proteina cosiddetta “etichetta” (b-Gal o GFP o GST) cDNA MCS cDNA MCS Proteina di fusione

5. La proteina di fusione deve essere nella corretta cornice di lettura

6. Il dominio di legame all’ormone e’ sufficiente per mediare la traslocazione nel nucleo in risposta ad ormone

7. Organizzazione del genoma e sua evoluzione

8. I processi evolutivi sono caratterizzati dalla selezione di mutazioni casuali della sequenza degli acidi nucleici che conferiscono alle specie nuove caratteristiche favorevoli alle condizioni ambientali. Durante il corso dell’evoluzione uno dei fattori più importanti è stato la possibilità di produrre nuove proteine da quelle già esistenti. Ma come sviluppare rapidamente nuove proteine?

9. Mutazioni puntiformi Wild type M L K F K Y G V L N ATG TTG AAG TTC AAG TAT GGT GTG CTG AAC Missense M L K F K F G V R N ATG TTG AAG TTC AAG TTT GGT GTG CGG AAC Non sense M L K F K - ATG TTG AAG TTC AAG TAG GGT GTG CTG AAC Frame-shift M L K F K Y K V C - ATG TTG AAG TTC AAG TAT AAG GTG TGC TGA

10. Grossi rimaneggiamenti del genoma I grossi rimaneggiamenti del genoma, come le duplicazioni, le inserzioni, le inversioni e le delezioni possono determinare cambiamenti molto più rapidi e radicali nella struttura dei geni. Oltre a ciò, possono determinare profondi cambiamenti nelle modalità con cui i geni si esprimono.

11. Duplicazione di segmenti cromosomici o di interi cromosomi Duplicazione genica Il progetto genoma ha evidenziato che questi fenomeni sono più frequenti ed estesi di quanto si pensasse La duplicazione di tratti più o meno estesi del genoma costituisce un meccanismo evolutivo fondamentale, in quanto consente, nello stesso tempo, di mantenere i geni che hanno avuto successo, e di sviluppare nuove funzioni a partire da questi.

12. I meccanismi di duplicazione e diversificazione consentono di generare facilmente nuove varianti di una proteina

13. I meccanismi di duplicazione e diversificazione consentono di generare facilmente nuove proteine combinando diversi domini funzionali Superfamiglia delle immunoglobuline

14. L’organizzazione del genoma in esoni ed introni è una caratteristica molto antica, che rende molto più dinamica l’evoluzione dei genomi

15. L’organizzazione del genoma in esoni ed introni rende molto più semplice l’evoluzione di nuove proteine in seguito a ricombinazione del DNA. Infatti i moduli funzionali di cui sono costituite le proteine si trovano su singoli esoni o su blocchi di esoni, e questo ha consentito un notevolissimo ‘rimescolamento’ di questi domini durante l’evoluzione

16. L’organizzazione del genoma in esoni ed introni rende molto più semplice la produzione di varianti di una proteina a partire dalla stessa unità trascrizionale

17. L’organizzazione del genoma in esoni ed introni rende molto più semplice la produzione di varianti di una proteina a partire dalla stessa unità trascrizionale

18. I TRASPOSONI I trasposoni sono elementi mobili che si trovano nel genoma di tutti gli organismi. Sono in grado, con meccanismi diversi, di saltare da un punto all’altro del genoma. Questi salti possono determinare drastici cambiamenti nella struttura e nelle modalità di espressione dei geni. Appartengono a diverse classi, accomunate dalla caratteristica di avere la sequenza trasposta fiancheggiata da corte sequenze ripetute generate dalla duplicazione di una sequenza nel sito bersaglio Sotto certi aspetti possono essere considerati come elementi parassitari, e in effetti alcuni di essi sono imparentati con particolari famiglie di virus (retrovirus). Tuttavia rappresentano un formidabile fattore positivo per i processi evolutivi. Non a caso circa il 45% del genoma umano e’ costituito da residui di trasposoni.

19. IR IR Escissione Inserzione Trasposoni che si muovono direttamente Trasposasi

20. Autonomi IR Trasposasi IR Difettivi Trasposasi mutata IR IR Alcuni trasposoni sono portatori di mutazioni nel gene che codifica la trasposasi, per cui non si possono muovere autonomamente. Esempi: Elementi Ac e Ds di mais. Trasposone batterico IS10.

21. IR LTR mRNA cDNA Integrazione Trasposoni che si muovono indirettamente (retrovirus endogeni e retrotrasposoni o retroposoni) LTR IR Proteasi Integrasi RT RNAsi-H Gli pseudogeni che si ritrovano nel genoma umano sono spesso derivati da eventi di retrotrasposizione

22. Trasposone D A B C E F ATG * D A B C E F Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Inserzione nella sequenza codificante (o nelle sequenze di controllo) con inattivazione totale o parziale del gene. Per questa proprietà, i trasposoni sono molto utilizzati per mutagenizzare e successivamante identificare i geni responsabili di particolari fenotipi. Un organismo che si presta molto bene a questo è Drosophila Melanogaster.

23. Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Diversi tipi di mutazione nei punti di inserzione, sia quando si inseriscono che quando si escindono.

24. Retroposone LTR LTR D A B C E F ATG * A B C D E F Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Attivazione trascrizionale del gene

25. Trasposone Promotore D A B C E F A B C D E F Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Produzione di nuove varianti alternative di una proteina

26. Che cosa possono fare i trasposoni saltando nel genoma? Produzione di nuove proteine

27. La mobilità dei trasposoni può essere molto pericolosa per le cellule somatiche, ma la sua attività nella linea germinale aumenta le probabilità di avere organismi con nuove caratteristiche, che possono rivelarsi vincenti in rapporto alle condizioni ambientali

28. DNA ripetitivo nel genoma umano 1: DNA umano 2: DNA batterico

29. Microsatelliti Unità > 4bp Segmenti lunghi fino150 5’-CACACACACACA-3’ Digestione Gradiente di densità DNA ripetitivo nel genoma umano DNA ripetuto in tandem Satellite Unità da 5 a 200 bp Segmenti lunghi fino a qualche centinaio di chilobasi (es. DNA satellite centromerico) Minisatelliti Unità da fino a 5 bp Segmenti lunghi fino a 25 kb (es. DNA telomerico - TTAGGG DNA minis. ipervariabile ->DNA fingerprint)

30. Geni e sequenze associate 900 Mb DNA extragenico 2100 Mb Non codificante 810 Mb Codificante 90 Mb DNA unico e a basso numero di copie 1680 Mb DNA ripetitivo 420 Mb Introni Pseudogeni Ripetuto in tandem Disperso Regioni di controllo Minisatelliti Microsatelliti SINE LINE Satellite Retroposoni Genoma Umano 3000 Mb Il DNA spazzatura è veramente tale?