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ELISA 操作技术培训指南

ELISA 操作技术培训指南. 徐灵龙 质控及技术服务专员 （ 010-80489131-357 ； 13241817666 ）. 2. 1. 4. 操作问题分析. IDEXX 试剂盒. 试剂盒的处理. 3. ELISA 操作. 报告内容. IDEXX 试剂盒 —— 试剂盒的组成. 包被板 ( Coated Plates ) 阳性对照 (Positive Control) 阴性对照 (Negative Control)

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  1. ELISA操作技术培训指南 徐灵龙 质控及技术服务专员 （010-80489131-357；13241817666）

  2. 2 1 4 操作问题分析 IDEXX试剂盒 试剂盒的处理 3 ELISA操作 报告内容

  3. IDEXX 试剂盒 ——试剂盒的组成 • 包被板 (Coated Plates) • 阳性对照 (Positive Control) • 阴性对照 (Negative Control) • 酶标抗体 (Conjugate ) • 底物液 (TMB Substrate) • 样品稀释液 (Sample Diluent) • 终止液 (Stop Solution) • 浓缩洗涤液 (Wash Concentrate) Never mix reagents from different kit lots!

  4. IDEXX试剂盒 ——自备器材 • 移液器及吸头 • 洗涤系统 • 酶标仪 • 蒸馏水或去离子水 • 其它（加样槽、量筒等） Maintenance & Calibrate Equipments

  5. 试剂盒的处理 ——接收试剂盒 • 检查外包装是否完好； • 记录接收日期； • 检查批号及效期； • 检查内容物； • 使用记录； • 先进先出原则（FIFO）； • 试剂盒的保存。

  6. ELISA操作 ——操作前的准备 • 试剂盒组分的回温； • 仔细阅读操作说明书； • 记录实验室的温度； • 确认反应温度； • 确定所用仪器的工作状态。

  7. ELISA操作 ——样品的处理 • 样品的类型 • 血清/血浆样品 • 肉汁样品 • 乳汁样品 • 其他样品：如蛋清、泄殖腔拭子等

  8. ELISA操作 ——样品的处理 • 样品的质量 • 避免使用严重溶血的样品。 • 避免使用脂状的样品。

  9. ELISA操作 ——样品的处理 • 样品的保存 • 血清存储在4-7度不能超过3-5天，若更长时间的保存则应存放于-20度或更低温度。 • 避免反复冻融样品，且冻融样品的混匀亦应注意避免剧烈震荡。 • 样品在保存中如出现污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后再取上清进行检测。

  10. ELISA操作 ——样品及其它试剂的配制 • 样品的制备 • 1：2 稀释 • 1: 5 稀释 • 1: 10 稀释 • 1: 20 稀释 • 1: 40 稀释 • 1：100稀释（两步进行） • 1：500稀释（两步或三步进行） • 洗涤液的配制 • 对照的处理（是否需要稀释）

  11. ELISA操作 ——移液技术 • 检查移液器的滴头。 • 取样量要严格。 • 要避免加在孔壁上部，不可溅出。 • 要减少第一个样品和最后一个样品加入到板内的时间差距。应记住在取每一个样品前必须更换吸头。

  12. ELISA操作 ——孵育反应 • 孵育反应是影响测定结果的一个重要因素，这一步也是ELISA实际操作中容易出现问题的地方。 • 过夜孵育时应保证反应板的密封。 • 室温孵育时，应保证温度在20-25℃之间，不应超过25℃。避免把反应板放在阳光下或空调风口处。 • 37℃孵育时应保证足够的反应时间。

  13. ELISA操作 ——控制反应时间 • 多块板的操作 • 板之间的适当的时间间隔 • 每块板一个计时器

  14. ELISA操作 ——反应板的洗涤 • 手工洗板 • 洗板之前标记每个板条 • 彻底甩掉孔中液体，在吸水纸上拍干 • 加入下一试剂前避免孔干燥 • 洗板机洗板 • 检查设备的性能 • 清洗和保持 • 核对内容物以确定洗涤剂的数量

  15. ELISA操作 ——读板及数据管理 • 参照酶标仪厂家的说明书。 • 选择恰当的波长，一般为450nm或650nm，使用630nm和620nm会使对照和样品值都下降，但不影响结果。 • 在加入终止液后要尽可能早地进行读数（提前打开酶标仪并设计好模板） • 使用Xchek进行读数和数据管理。

  16. IDEXX实验室操作规范

  17. IDEXX实验室操作规范

  18. 良好的仪器 ELISA操作 ——必要条件！！！ 充分准备 优质的试剂 正确的操作

  19. 2 1 4 操作问题分析 血清学检测 试剂盒的处理 3 ELISA操作 报告内容

  20. O.D.值偏低： • 温度 • 孵育时间 • 洗涤 • 试剂盒 • 对照品稀释 • 试剂…… • O.D.值偏高： • 实验室温度 • 水质 • 洗涤 • 酶标仪读数 • 孔内气泡 • 底物溶液…… 操作常见问题分析 常见问题分析

  21. 操作常见问题分析 无颜色产生 板内重复性低 板间重复性低 • 试剂添加 • 样品是否加入 • 酶标记物 • 操作时间过长 • 洗涤不稳定 • 抗体分布不均 • 多道移液器 • 孵育 • 洗涤 • 对照与样品 • 不同批次

  22. 操作常见问题分析 • 导致不正常实验结果的常见因素： • 温度（试剂、孵育以及实验室） • 不同批次的试剂混用 • 水质好坏 • 酶标仪问题 • 试剂污染 • 用错了试剂瓶 • 终止液有结晶 • 读数时样品板孔有气泡 不明原因……

  23. 孔内有气泡存在会严重的影响结果 ！！！

  24. 欢迎提出宝贵意见！

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