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Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surex

Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur. Soutenance de thèse de M. Thomas PERROTTON Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY 14 Décembre 2007 – 14h30

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Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surex

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  1. Étude du transporteur MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur Soutenance de thèse de M. Thomas PERROTTON Directeur de thèse : Dr. Hélène CORTAY 14 Décembre 2007 – 14h30 Laboratoire des Protéines de Résistance aux Agents Chimiothérapeutiques Dr. Attilio DI PIETRO Institut de Biologie et Chimie des Protéines

  2. SOMMAIRE • RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES • Le cancer : un enjeux sociétal et économique • Le phénotype de résistance des cancers • Les transporteurs ABC • Le transporteur de multiples drogues MRP1 • Les modulateurs de MRP1 • RESULTATS • Caractérisation fonctionnelle des NBD • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil • sur MRP1 • Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil • CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES Thomas PERROTTON - IBCP

  3. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES • Le cancer : un enjeux sociétal et économique • Le phénotype de résistance des cancers • Les transporteurs ABC • Le transporteur de multiples drogues MRP1 • Les modulateurs de MRP1 Thomas PERROTTON - IBCP

  4. Le cancer est une maladie qui nous concerne tous. Chaque année, 280 000 nouveaux cas sont diagnostiqués ; le cancer tue 150 000 personnes par an. Il est la première cause de mort prématurée. • Le cancer : un enjeu sociétal et économique Thomas PERROTTON - IBCP

  5. Le cancer : un enjeu sociétal et économique « Analyse économique des coûts du cancer en France », Institut national du cancer, 10 avril 2007 (dossier de presse) Thomas PERROTTON - IBCP

  6. 22 2 1 3 1 4 4 • Le phénotype de résistance des cancers • Un échec majeur des chimiothérapies, dû au traitement par des médicaments • Résistance croisée à de nombreux agents chimiothérapeutiques Inactivation moléculaire Anomalies de réponses (apoptose, augmentation de la réparation de l’ADN) Altération de la cible moléculaire (ADN topoisomérases) Efflux actif en dehors de la cellule (transporteurs ABC) Thomas PERROTTON - IBCP

  7. Les transporteurs ABC Généralités • Une très large famille de protéines • Présents des microorganismes à l’Homme • Une séquence hautement conservée : ATP Binding Cassette • Une classification unique (HUGO) : → homologie structurale • Trois transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR: • P-gp/ABCB1 (Glycoprotéine-P) • MRP1/ABCC1 (Multidrug Resistance Protein 1) • BCRP/ABCG2 (Breast Cancer Resistance Protein) Thomas PERROTTON - IBCP

  8. Les transporteurs ABC Les pathologies associées aux transporteurs ABC • Des transporteurs impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques • Des mutations associant souvent ces transporteurs à des maladies Thomas PERROTTON - IBCP

  9. Les transporteurs ABC Topologie générale des transporteurs ABC • Une topologie générale • 2 domaines transmembranaires (TMD) : reconnaissent les substrats • 2 domaines de fixation des nucléotides (NBD) : fournissent l’énergie Thomas PERROTTON - IBCP

  10. Les transporteurs ABC Les domaines de fixation des nucléotides ou NBD • Des motifs inclus dans les NBD très conservés • Motif A de Walker • Motif B de Walker • Motif C, signature des ABC 1 2 3 2 3 1 Thomas PERROTTON - IBCP

  11. Les transporteurs ABC Les différentes étapes du transport d’un substrat par un transporteur ABC Higgins CF, et al. (2004)Nat Struct Mol Biol 11(10):918-26 Thomas PERROTTON - IBCP

  12. TMD2 TMD3 TMD1 NBD1 NBD2 • Le transporteur de multiples drogues MRP1 Une topologie originale de MRP1 • Un domaine transmembranaire supplémentaire en position N-terminale Thomas PERROTTON - IBCP

  13. Le transporteur de multiples drogues MRP1 Des NBD originaux au fonctionnement asymétrique • Des différences structurales • Une asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 • La structure de NBD1 a été résolue • Conformation non productive du site catalytique • Peut expliquer la régulation entre NBD1 et NBD2 Ramaen O, et al. (2006) J Mol Biol359:940-949 Thomas PERROTTON - IBCP

  14. Le transporteur de multiples drogues MRP1 Une grande diversité de substrats transportés • Transports d’anions organiques • transports de substrats conjugués: GSH, glucuronates, sulfonates • Co-transport de substrats avec du GSH Médicaments xénobiotiques Médicaments xénobiotiques conjugués Composés naturels Thomas PERROTTON - IBCP

  15. Le transporteur de multiples drogues MRP1 Différents mécanisme de transport Extracellulaire • Transport du GSH et du GSSG • Transport du LTC4 Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD1 NBD2 NBD2 • Transport de l’estrone sulfate ATP • Transport de la vincristine Vérapamil Estrone sulfate GSSG • Effet du vérapamil Vincristine LTC4 GSH GSH GSH Thomas PERROTTON - IBCP GSH

  16. Les modulateurs de MRP1 Pourquoi rechercher des modulateurs pour MRP1? • Unobjectif : contrecarrer la chimiorésistance • Une stratégie : inhiber le transporteur • Des solutions : flavonoïdes et vérapamil Thomas PERROTTON - IBCP

  17. LES OBJECTIFS DE CES TRAVAUX Mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de MRP1 Caractériser la fonctionnalité et l’implication des NBD vis-à-vis des nucléotides, substrats et modulateurs Étudier les énantiomères du vérapamil, comprendre leur activité Déterminer de nouvelles structures efficaces, et comprendre pourquoi Analyser une nouvelle stratégie de lutte contre la chimiorésistance induite par MRP1 Améliorer les modulateurs actifs Thomas PERROTTON - IBCP

  18. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES • Le cancer : un enjeux sociétal et économique • Le phénotype de résistance des cancers • Les transporteurs ABC • Le transporteur de multiples drogues MRP1 • Les modulateurs de MRP1 • RESULTATS • Caractérisation fonctionnelle des NBD • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil • sur MRP1 • Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Thomas PERROTTON - IBCP

  19. RESULTATS • Caractérisation fonctionnelle des NBD Thomas PERROTTON - IBCP

  20. Caractérisation fonctionnelle des NBD Généralités • Asymétrie fonctionnelle des NBD de MRP1 • Rôle de cette asymétrie encore inconnue • Changements conformationnels induits par l’ATP sur les NBD : transfert d’information vers les TMD • Interaction de flavonoïdes avec les NBD de MRP1 Interaction des substrats et modulateurs sur les NBD ? ? Propriété de fixation des nucléotides sur les NBD ? Conseil G, et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 18;95(17):9831-6 Trompier D, et al. (2003) Cell Mol Life Sci. 60(10):2164-77 Thomas PERROTTON - IBCP

  21. 0,6 0,5 0,4 0,3 mol probe / mol protéine 0,2 0,1 0,0 0 100 200 300 8N AXP (µM) 3 • Caractérisation fonctionnelle des NBD Nucléotides et NBD : interaction et modifications conformationnelles ○ NBD2 8-azido-[α-32P]ATP NBD2 8-azido-[α-32P]ADP ● NBD1 8-azido-[α-32P]ATP ▲NBD1 8-azido-[α-32P]ADP • Fort marquage par l’ATP sur NBD1, faible pour l’ADP • Faible marquage sur NBD2 NBD2 NBD1 • L’ATP et l‘ADP modifie l’accessibilité des Trp de NBD1 • Seul l’ADP modifie l’accessibilité de NBD2 ● NBD seul ■ + ATP-Mg ▲+ ADP-Mg Thomas PERROTTON - IBCP

  22. Caractérisation fonctionnelle des NBD Fixation du LTC4 et du MK571 ● NBD1 ■NBD2 • Fixation du LTC4 sur les deux NBD NBD1 Kd = 5.8 ± 0.4 µM NBD2 Kd = 8.2 ± 0.7 µM ● NBD1 ■NBD2 • Fixation du MK571 sur les deux NBD NBD1 Kd = 6.0 ± 1.3 µM NBD2 Kd= 3.9 ± 1.6 µM Thomas PERROTTON - IBCP

  23. Caractérisation fonctionnelle des NBD Les NBD et le NMeOHI2 NBD2 NBD1 A B ● NBD seul ■ 10 µM NMeOHI2 ▲30 µM NMeOHI2 • Modification de l’accessibilité des Trp de NBD1 par le NMeOHI2 • Modification différente de l’ATP • Interaction au même site que le MK571 ● NBD1 seul ■ 30 µM NMeOHI2 ▲30 µM NMeOHI2 + 2 mM ATP-Mg Thomas PERROTTON - IBCP

  24. Caractérisation fonctionnelle des NBD Changements conformationnels induits par les substrats et modulateurs NBD1 NBD2 ○ NBD seul ■ 30 μM docetaxel ▲ 30 μM vincristine ▼ 30 μM vinblastine ◊ 5 mM GSH □ 5 μM LTC4 • Tous les composés modifient l’accessibilité des Trp de NBD1 • Seuls le GSH et le LTC4 modifient l’accessibilité des Trp de NBD2 Thomas PERROTTON - IBCP

  25. Conclusions résultats 1 Interaction Interaction LTC4 MK571 NMeOHI2 LTC4 MK571 NMeOHI2 NBD1 NBD2 ATP ATP Modifications Conformationnelles Modifications Conformationnelles Vincristine Vinblastine GSH LTC4 GSH LTC4 Thomas PERROTTON - IBCP

  26. Conclusions résultats 1 • Les nucléotides et les NBD: • → Comportement intrinsèque asymétrique vis-à-vis des nucléotides • → Changements conformationnels pouvant expliquer le • rôle de chaque NBD dans le mécanisme catalytique • → Les domaines recombinants sont fonctionnels • Les substrats/modulateurs et les NBD: • → Participation des NBD à la fixation des substrats • et modulateurs? • → Validation par d’autres techniques (photomarquage, • mutagenèse, …) Thomas PERROTTON - IBCP

  27. RESULTATS • Caractérisation fonctionnelle des NBD • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil • sur MRP1 Thomas PERROTTON - IBCP

  28. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Le vérapamil • Un dérivé diphénylalkylamine • Inhibiteur des canaux calciques de type L (cœur) • Utilisation en thérapeutique: hypertension, arythmie * • L’énantiomère S est pharmacologiquement efficace • L’énantiomère S est beaucoup plus vite métabolisé Thomas PERROTTON - IBCP

  29. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du vérapamil sur MRP1 Vérapamil Cellules BHK-21 Vérapamil Cellules BHK-MRP1 • Fuite massive du GSH intracellulaire • Mort des cellules surexprimant MRP1 par apoptose Trompier D, et al. (2004) Cancer Res64:4950-4956 Low DW, et al. (2000) J Pharmacol Exp Ther293(2):530-8 Thomas PERROTTON - IBCP

  30. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Le vérapamil et ses énantiomères • Les énantiomères : 60 milliards de dollars dépensés chaque année aux USA • Effet physiologique différentiel des énantiomères de molécules Thalidomide Ibuprofène • Vérapamil: inhibiteur de référence de la glycoprotéine -P • Même activité des énantiomères sur la glycoprotéine-P et sur MRP1 …? Thomas PERROTTON - IBCP

  31. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Cytotoxicité des énantiomères du vérapamil ○ vérapamil +/- □ vérapamil S  vérapamil R ● vérapamil +/- ■ vérapamil S ▲ vérapamil R BHK-21 BHK-21-MRP1 • Seul le S-verapamil induit une cytotoxicité des cellules BHK-MRP1 Thomas PERROTTON - IBCP

  32. Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de GSH par MRP1 ○ 10 µM vérapamil +/- □ 5 µM vérapamil S  5 µM vérapamil R ● 10 µM vérapamil +/- ■ 5 µM vérapamil S  5 µM vérapamil R BHK-21 BHK-21-MRP1 • L’effet du S-vérapamil est plus fort en absence de l’énantiomère R Thomas PERROTTON - IBCP

  33. ● 0 µM vérapamil R ■ 2 µM vérapamil R ▲ 4 µM vérapamil R BHK-21-MRP1 • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du R-vérapamil sur l’activité du S-vérapamil • Inhibition de type mixte de l’isomère R sur l’activité de l’isomère S Thomas PERROTTON - IBCP

  34. BHK21 Verapamil R Verapamil S MK571 Contrôle Verapamil S BHK21-MRP1 MK571 Verapamil R Contrôle • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur le transport de calcéine • Aucun effet sur les cellules contrôles • Les 2 énantiomères inhibent l’efflux de calcéine Thomas PERROTTON - IBCP

  35. BHK21 BHK21-MRP1 • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Réversion du phénotype MDR par le R-vérapamil 0 µM 5 µM 15 µM • Le vérapamil R réverse le phénotype MDR induit par MRP1 Thomas PERROTTON - IBCP

  36. MW (KDa) MW (KDa) 205 - 220 - MR P1 MRP1 170 - 115 - 116 - 97 - 76 - SDS-PAGE 6%, Coomassie Western Blot, Lumilight® • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Purification de MRP1 à l’aide des cellules BHK-MRP1 Dépôt de 1.5 µg de protéines purifiées • Purification de MRP1 20 boites de 15 cm Ø ~ 200 µg Concentration ~ 0.07 µg/µl Thomas PERROTTON - IBCP

  37. Pas d’asolectine 0.2 % asolectine ▲0.5 µM R-vérapamil ■0.5 µM S-vérapamil ●MRP1 seul • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Changements conformationnels induits par les énantiomères du vérapamil MRP1 seul KSV = 1.23 ± 0.15 M-1 0.5 µM R-vérapamil KSV = 2.51 ± 0.17 M-1 0.5 µM S-vérapamil fa = 0.45 MRP1 seul KSV = 1.46 ± 0.23 M-1 0.5 µM R-vérapamil fa = 0.42 0.5 µM S-vérapamil fa = 0.48 • L’asolectine modifie l’accessibilité des Trp • Les deux énantiomères induisent des changements conformationnels différents Thomas PERROTTON - IBCP

  38. S-vérapamil R-vérapamil • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Fixation du S- et R-vérapamil sur MRP1 purifiée R-vérapamil Kd = 47.7 ± 4 nM S-vérapamil Kd= 92.5 ± 5 nM • Fixation du S et R-verapamil sur MRP1 Thomas PERROTTON - IBCP

  39. 0.5 µM R-vérapamil 0.05 µM R-vérapamil MRP1 seul • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du R-vérapamil sur la fixation su S-vérapamil, topologie des sites de fixation • Modification de la fixation du S-vérapamil par le R-vérapamil Thomas PERROTTON - IBCP

  40. S-vérapamil R-vérapamil MRP1 seul ■0.5 mM GSH • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet du GSH sur la fixation du S-vérapamil et du R-vérapamil • Modification de l’interaction des deux énantiomères avec MRP1 par le GSH • Interdépendance entre les sites de fixation des énantiomères et du GSH Thomas PERROTTON - IBCP

  41. Pas d’asolectine 0.2 % asolectine 5 mM GSH 1 µM S- ou R-vérapamil 0.8 mM vanadate • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil sur MRP1 Effet des énantiomères du vérapamil sur l’activité ATPase De MRP1 purifiée Activité basale : 2.11 ± 0.1 nmol/min/mg Activité basale : 16.2 ± 0.4nmol/min/mg • Modification de l’activité ATPase par l’asolectine • Abolition des effets du GSH sur l’activité ATPase par le S-vérapamil, par d’effet du R-vérapamil Thomas PERROTTON - IBCP

  42. Conclusions résultats 2 • Effets biologiques différents: → seul le S-vérapamil induit l’efflux du glutathion, • entraînant la mort cellulaire • → le R-vérapamil agit comme un inhibiteur de MRP1 • - Les deux énantiomères ont des sites de fixation interdépendants • Il faut choisir entre les deux énantiomères pour cibler • MRP1 de manière plus efficace, et selon deux aspects: • Le R-vérapamil a deux avantages: • → il est peu cardiotoxique • → il réverse le phénotype MDR • Le S-vérapamil a l’avantage de tuer spécifiquement • les cellules susceptibles de devenir résistantes, • par induction de l’apoptose INTÉRÊT DE CES RÉSULTATS = NOUVELLES STRATEGIES Perrotton T, et al. (2007) J Biol Chem26;282(43):31542-8 Thomas PERROTTON - IBCP

  43. Activité du S-vérapamil sur MRP1 • Transport du GSH, et de la vincristine en co-transport avec le GSH Extracellulaire • Fixation du S-vérapamil R S • Modification de la conformation de MRP1 Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD2 ATP • Transport massif du GSH S GSH GSH • Inhibition du transport de la vincristine Vincristine GSH Vincristine GSH GSH GSH GSH Thomas PERROTTON - IBCP

  44. Activité du R-vérapamil sur MRP1 Extracellulaire • Transport du GSH et de la vincristine en co-transport avec le GSH • Fixation du R-vérapamil R S Intracellulaire • Modification de la conformation de MRP1 NBD1 NBD2 ADP+Pi ATP • Inhibition du transport de la vincristine et du GSH GSH GSH GSH R GSH GSH Vincristine Vincristine GSH GSH Thomas PERROTTON - IBCP

  45. Sites de fixation des énantiomères du vérapamil Extracellulaire La fixation du R-vérapamil sur MRP1 modifie la fixation du S-vérapamil R S Interdépendance des sites de fixation des énantiomères du vérapamil Intracellulaire ADP+Pi NBD1 NBD2 ATP R S Thomas PERROTTON - IBCP

  46. Conclusions résultats 2 • Synthèse des énantiomères diiodés du vérapamil, pour une meilleure efficacité à plus faible concentration • Etudier l’influence des énantiomères du vérapamil sur la fixation du glutathion sur MRP1, intérêt mécanistique • Etudier l’influence du phénotype cellulaire sur l’activité du S- vérapamil • Passer à un modèle animal Thomas PERROTTON - IBCP

  47. RESULTATS • Caractérisation fonctionnelle des NBD • Activité différentielle des énantiomères du vérapamil • sur MRP1 • Relation structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Thomas PERROTTON - IBCP

  48. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Structure chimique des dérivés iodés du vérapamil 4 2 3 4 Partie « ouest » Partie « est » Thomas PERROTTON - IBCP

  49. Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Cytotoxicité des dérivés iodés du vérapamil • L’iodation augmente l’efficacité des molécules en général Thomas PERROTTON - IBCP

  50. Vérapamil NHOHI NMeOHI2 C • Relations structure/activité des dérivés iodés du vérapamil Toxicité cellulaire du vérapamil et de deux dérivés actifs F > 10 F ~ 18 F ~ 49 • Trois composés intéressants Thomas PERROTTON - IBCP

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