1 / 17

Imunochemické metody

Imunochemické metody. Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou. Vytášek 2008. Vazba mezi antigenem a protilátkou. Je nekovalentní a podílí se na ní vodíkové můstky a iontové interakce stejně jako van der Waalsovy síly či interakce dipol-dipol

efrat
Download Presentation

Imunochemické metody

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Imunochemické metody Metody využívající vazbu mezi antigenem a protilátkou Vytášek 2008

  2. Vazba mezi antigenem a protilátkou • Je nekovalentní a podílí se na ní vodíkové můstky a iontové interakce stejně jako van der Waalsovy síly či interakce dipol-dipol • Sílu interakce (vazby) mezi antigenem a protilátkou vyjadřuje afinitní konstanta KA = [Ab-Ag] / [Ab].[Ag] • Afinitní konstanta, tj. síla vazby, je závislá na pH, iontové síle, přítomnosti detergentů či chaotropních činidel

  3. Hlavní imunochemické metody • Imunoeseje • Imunoblotování • Imunoprecipitace • Imunoafinitní chromatografi • Imunosensory

  4. Imunoeseje Princip metody je založen na přidání malého množství značené protilátky nebo antigenu k studované směsi antigen-protilátka a stanovení této značené komponenty ve výsledném imunokomplexu. Množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených komponent. Nezbytnou podmínkou využití těchto metod pro analýzu antigenů je, aby antigen byl rozpustný v pufru zhruba fysiologického pH, osmolarity a bez detergentů rušících vazbu antigen-protilátka.

  5. Imunoeseje Dle provedení : • Homogenní • Heterogenní – jedna z komponent (Ag nebo Ab) je navázána na pevnou fázi Dle značení : • Značení radioisotopem (RIA) • Značení enzymem (EIA) • Značení fluoreskujícími barvičkami Značení přímé Značení nepřímé – často využívané pro značení protilátky (primární protilátka je neznačena a pak se použije druhá protilátka ,která je druhově specifická a nese značku (tento typ značené protilátky je běžně komerčně dostupný)

  6. Imunoesej s ukotveným antigenem V základní podobě se využívá pro stanovení specifických Ab proti ukotvenému antigenu (obvykle s nepřímým značením)

  7. Imunoesej s ukotvenou protilátkou

  8. Sandvičová imunoesej

  9. Stanovení antigenu kompetetivní EIA s ukotveným antigenem Opláchnutí a inkubace se sekundární protilátkou vhodně značenou (enzymem či radioisotopem)

  10. Kompetetivní EIA na ukotveném antigenu Koncentrace antigenu

  11. Imunoblotování (Western blotting) • kombinuje separační účinnost gelové elektroforesy se specifitou detekce na basi vazby antigen-protilátka • semikvantitativní metoda • umožňuje sledovat i antigeny nerozpustné v běžných pufrech

  12. Imunoblotování – princip metody • separace jednotlivých vzorků gelovou elektroforesou (obvykle SDS-PAGE) • přenos rozdělených polypeptidů z gelu na vhodnou membránu (nitrocelulosu) • blokování nespecifických vazebných míst membrány • inkubace membrány se specifickou protilátkou (primární protilátkou) • inkubace s druhou protilátkouvhodně značenou(tzv. sekundární Ab) proti imunoglobulinům zvířecího druhu primární protilátky • detekce specifických antigenů pomocí značení

  13. Mapování epitopu. Imunobloty tryptických štěpů COMP 0 mmol/l Ca2+ 0°C, 30 min 12.5 mmol/l Ca2+ 37°C 6hod 12.5 mmol/l Ca2+ 0°C, 30 min

  14. Densitometrické hodnocení imunoblotů COMP ze synoviální tekutiny s třemi různými monoklonálními protilátkami

  15. Tvorba precipitujícího imunokomplexu

  16. Heidelbergerova precipitační křivka

  17. Imunosensory • princip je podobný heterogenní EIA, ale stanovení imunokomplexu se provádí bez značené komponenty měřením elektrických či optických změn na sensoru s navázaným imunokomplexem • QCM (quartz crystall microbalance) - pokles frekvence oscilátoru s křemenným krystalem je úměrný hmotě navázané na povrch křemenného krystalu • SPR (surface plasmon resonance) - optického jev vznikajícího na tenkých vrstvách nebo na nanočásticích je úměrný celkové adsorbované hmotě na povrchu tenké vrstvy či nanočástic

More Related