Márquez Carrillo Miguel E duardo

1. Departamento de Ciencias de la Vida Ingeniería en Biotecnología ʺCaracterización molecular de 297 genotipos de trigo (Tritticum aestivum L.) provenientes del Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo e inferencia de su estructura genéticaʺ Márquez Carrillo Miguel Eduardo Directora: M. Sc. Fernanda Loayza Codirectora: B. Sc. Karina Ponce

3. Introducción • Roya Amarilla (Puccinia striiformis) • Fusariosis de la espiga (Fusarium graminearum)

4. Introducción Caracterización Molecular

5. Introducción

6. Introducción

7. Justificación

8. Objetivos Específicos General

9. Hipótesis H0: • La colección de 297 genotipos de trigo provenientes del Centro Internacional de mejoramiento de maíz y trigo no está estructurada genéticamente.

10. METODOLOGIA DEL PROCESO Material vegetal Extracción de ADN Cuantificación de ADN PCR con el Método M13-tailing Validación con SSRs Pruebas PCR Pruebas Dúplexaje Selección de SSRs GENOTIPAJE en el LI-COR 4300 s Diseño Estadístico

11. MATERIAL VEGETAL 297 líneas avanzadas colectadas por todo el mundo por el CIMMYT

12. METODOLOGIA M13-Tailing Marcadores SSRs Secuencia de nucleótidos (5´-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3`) M-13 tailing Extremo 5’ del primer Fw SSRs PCR + M13 Primer (700-800nm) Productos amplificados SSR marcados Imágenes digitales Laser LICOR detectan la IR SAGA-GT Genotipaje 2pb

13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ANÁLISIS • Diversidad genética • Estructura genética • Correlación fenotípica PROGRAMAS ESTADISTICOS SSRs seleccionados Matriz Genotípica de datos

14. Resultados Extracción de ADN • En las extracciones de ADN se obtuvieron rendimientos promedio de 400 ng/µL para extracción con muestra fresca y protocolo casero • A partir de muestra seca, el rendimiento fue de 100 ng/µL • Optimización de tiempo y costos en el laboratorio.

15. Resultados Validación de ADN • Se observaron bandas de amplificación con el marcador SSR BARC10 en un peso entre 300 y 350 pb Muestras vegetales

16. Resultados Validación de polimorfismo de primers • Se logró establecer la temperatura de 82 primers, de los cuales 33 eran explotables para la investigación

18. Resultados

19. Resultados Estandarización del Genotipaje

22. Resultados • Genotipaje de marcadores seleccionados SSR en LI-COR 4300S (corridas) • Los resultados del genotipaje se expresan en imágenes que el programa SAGA-GT reporta con los datos de peso molecular de los fragmentos.

23. Resultados • Registro de datos del LI-COR 4300S y análisis estadísticos • Datos compilados en una base de datos • Estimación de LD con el paquete Genetics v. 1.3.8.1, descartó 5 marcadores.

27. Resultados • Asignación genética • Utilizando el programa Structure, se hicieron los análisis de agrupación, simulando entre 1 a 10 subpoblaciones (k). • Utilizando el método de Evanno (2005), Delta K, se determinó (k=2)

28. Resultados • Mayoría de marcadores SSRs se encuentran en el genoma D • Necesario incluir marcadores presentes en todos los cromosomas para tener representatividad en cada grupo de ligamiento • Se utilizaron 45 marcadores SNPs corridos en la misma población.

29. Resultados • Asignación genética • Utilizando el programa Structure, se hicieron los análisis de agrupación, simulando entre 1 a 20 subpoblaciones (k). • Utilizando el método de Evanno (2005), Delta K, se determinó (k=3)

30. Resultados • Asignación genética • Después de haber realizado los análisis en el programa Structure, se presenta el grafico de barras de los coeficientes de pertenencia de los genotipos a las tres subpoblaciones determinadas

31. Resultados Análisis multivariado • Análisis de componentes principales a partir de un set de 3,700 SNP. • Gran parte de la varianza existente en la población es capturada en los tres primeros componentes principales

32. Resultados Análisis de componentes principales (ACP) • Se efectuó el PCA en dos dimensiones (2D), en el Programa Eigensoft versión 4.2, ya que se podía apreciar de mejor manera la separación genética de los 3 grupos conformados

34. Resultados • Correlación de datos fenotípicos

35. Resultados • Correlación de datos fenotípicos

36. Conclusiones • Con el protocolo utilizado para muestras frescas, se obtuvo altas concentraciones de ADN (hasta 3000 ng/ μl); mientras que con la metodología empleada para muestras secas se obtuvo menores concentraciones de ADN genómico (hasta 200 ng/ul), sin embargo este último resultado no afectó a nuestro estudio, ya que los marcadores SSRs requieren entre 5 a 20 ng/ul de ADN. • En función de optimizar tiempo y recursos, cuando se trabaja con especies alopoliploides como el trigo, se puede seleccionar primers que amplifiquen en diferentes cromosomas, asemejándose a tener una combinación multiplex, como fue con el primer WMC89 que amplifico en el cromosoma 4B y 4D. • Para obtener resultados objetivos en análisis de agrupamiento en trigo, es necesario tener datos genotípicos en todos los cromosomas de sus genomas.

37. Conclusiones • Para saturar regiones del genoma que no tengan cobertura, se puede utilizar marcadores basados en distintos principios como fue el caso de SSRs y SNPs, basta que estén en equilibrio de ligamiento. • Los estudios de diversidad genética reflejaron que para los 28 marcadores utilizados se hallaron 125 alelos con un promedio de 4.46 alelos por marcador. • El promedio PIC de los marcadores fue de 0.54 • Los análisis efectuados de agrupamiento y multivariados permitieron distinguir tres grupos genéticos, de características muy similares, ya que las subpoblación 1 agrupo a 96 individuos, la subpoblación 2 a 94 y la subpoblación 3 a 107. • La subpoblación 2 presenta 87% de plantas resistentes a roya amarilla

38. Recomendaciones • Al presentar la subpoblación 2 los mayores índices de plantas resistentes a roya amarilla, se puede recomendar utilizar esta subpoblación en futuros programas de mejoramiento. • Para mejorar la amplificación de marcadores SSRs, se puede optimizar el mix agregando BSA o modificar la concentración de MgCl2. • Se determinó que las condiciones óptimas de amplificación para los primers BARC19 y CFD84, deben ser con 0,1% de BSA en el mix • Para los primers BARC124 Y BARC133, se debe disminuir la concentración de MgCl2 a 1,5 mM para obtener mejor amplificación • Para realizar el análisis de estructura de la colección de líneas elites, es necesario contar con un ordenador de alto rendimiento, y que pueda garantizar estar encendido y con energía por más de 48 horas.

39. GRACIAS

40. Agradecimientos Dr. Eduardo Morillo Ing. Esteban Falconí Ing. Johana Buitron Lcda. Katerine Orbe José Moreno Personal del DNB M. Sc. Fernanda Loayza B. Sc. Karina Ponce Dpto. Ciencias de la vida