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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?. Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin. Themen. Molekulargenetische Methodik Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit. Ziel der PCR-Untersuchung.

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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

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  1. Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand? Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin

  2. Themen.. • Molekulargenetische Methodik • Verfügbare Systeme • Indikationen • Beispiele • AB0 • Rhesus • MNS • Kosten und Aufwand • Fazit Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  3. Ziel der PCR-Untersuchung Ziel der Serologie Grundlagen Protein chromosome RNA Zellkern Doppelsträngiges DNA Molekül Zellkern RNA Individual nucleotides Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  4. 5’ 3’ 5’ 3’ DNA-Vorlage (Template) 3’ 5’ 3’ 5’ Stränge werden getrennt Denaturierung Forward primer 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Verlängerung (Extension) Reverse primer Anlagerung Primer (anneal) Molekulargenetische Methodik • DNA-Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  5. Original-DNA Zielregion Thermal cycle Thermal cycle Thermal cycle Molekulargenetische Methodik • DNA-Vervielfältigung erfolgt Exponentiell 1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt. Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  6. Molekulargenetische Methodik • Amplifikatdarstellung Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  7. Detektor Fenster Molekulargenetische Methodik • Amplifikat wird in die Kapillare injiziert • Sequenzierung • Spannung wird angelegt • Amplifikate wandern zur Anode • Amplifikattrennung durch Länge:Große Stränge wandern langsamer durch das Gel • Farbfluoreszenz der endständigen Base wird detektiert Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  8. Molekulargenetische Methodik • weitere eingesetzte Verfahren • Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP) • PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide) • Real-time-Verfahren • Schmelzkurvenanalyse Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  9. Vorschriften • Richtlinien:Abschnitt 4.2.5„Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen.“MPG, QualitätssicherungRingversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNSKontrollen, „Testreagenzien“ Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  10. Verfügbare Testsysteme • sonstwie durchgeführt: • McCoy • Chido,Rodgers • Js(ab) • Lewis • Xg • Landsteiner-Wiener • Gerbich • Cromer • Ii • XK, Js(ab) • Scianna • T/Tn • P-Globoside • H/h • Indian • GIL, JMH, OK, RAPH • Kommerziell erhältlich: • AB0 • Rhesus • Kell, (Kk, Kp(ab)) • Kidd • MNS • Duffy • Lutheran • Cartwright (Yt) • Colton (Co) • Knops • Wright, Diego (Di) • Dombrock (Do) bisher nicht testbar (z.B.): Vel Lan Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  11. Verfügbare Testsysteme: eigene Tests • Interessante Web-Seiten zum Thema: • The Blood Group Antigen Gene Mutation Database:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/home • Rhesusbase:http://www.uni-ulm.de/~fwagner/RH/RB/ • NCBI Entrez Nucleotidehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  12. Indikationen • wissenschaftliche Fragestellungen • Zur Ergänzung von nicht eindeutigen serologischen Ergebnissen • Wenn keine serologischen Untersuchungen möglich sind: • unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphänomen oder z.B. AIHA • Bestimmung erythrozytärer Merkmale aus fetalen Materialien • genetische Disposition bei Risikoschwangerschaften • Untersuchung nach KMT, bei Chimärismus • forensische Fragestellungen • Vaterschaftsbegutachtung • kriminalistische Zuordnung von Spuren zu Tätern Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  13. Beispiele: AB0 • Das Gen für die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2 • Es kodiert für ein Enzym, das endständige Zucker an eine Grundsubstanz (H) anhängt • Aminosäurevarianten verursachen: • geringere Transferaseaktivität • Spezifitätswechsel des endständigen Zuckers Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  14. Beispiele: AB0 Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5) # Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zusätzlich 21 AS Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  15. Beispiele: AB0 • Probleme der AB0-Typisierung: • Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion. • Die Wertigkeit (Auswirkungsstärke) der spezifischen Aminosäuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel). • Letzter Ausschluß von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung). • Transfusionsrelevanz ?! Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  16. Beispiele: Rhesus • günstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein • Testmöglichkeiten: • RhD, C,c,E,e,Cw.. • schwaches D: Dweak oder D partial • D-Zygotiebestimmung • CE-Haplotypbestimmung Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  17. Beispiele: Rhesus Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  18. Beispiele: Rhesus Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  19. Beispiele: Rhesus Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  20. Beispiele: Rhesus • Probleme der Rhesus-Typisierung: • „PCR-positiv Serologie-negativ“ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrücken. • Was wird kodiert – was wird exprimiert? • c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung für C • bisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  21. X-Over NH2 Ser/Leu1SerThr Thr Gly/Glu5 Leu1SerThr Thr Glu5 ´N´ 1 M N 1 29 Met/Thr S s 72 COOH COOH 131 GpA Beispiele: MNS • Sialoglycoprotein • Glycophorin A (MN) und B (Ss) • Ausgeprägte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpAPNAS, 1989, 86, 4619ff • Nur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4). Exon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3´-UT NH2 324 395 1822 -28 2 15 227 377 1733 GpA G T GpB x x C T Proteinstart GpE GpB Homologe Region Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  22. Beispiele: MNS • Probleme der MNS-Typisierung • Protokolle zeigen Schwächen: • unterschiedliche Annealing-Temperaturen für M und N benötigt Transfusion, 1993, 33, 119ff • sehr lange Amplifikate Amplitype PE • Ausfälle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f Phänotyp alter Hybrid Name GP.Vw Mi.I A-B-A GP.Mur Mi.III B-A-BS GP.Bun Mi.VI B-A-B GP.HF Mi.X B-A-B Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  23. Beispiele: MNS • Probleme der MNS-Typisierung: Fall • Patientin E.K. 21 Jahre • Ak-Differenzierung: Anti-S, EA – • PCR: NNSs • Serologie: ss • Hybridmolekül; AS-Variante, die spezifisches Epitop für Ak zerstört? • Sequenzierung…. M M M N N M S s Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  24. weitere Probleme der BG-PCR: • das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phänotyp, sondern ein umwandelndes Enzym:z.B. Lewis, P1, Ii • Ringversuche, Qualitätskontrolle • Kontrollproben (positiv und negativ) • Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran… • seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX… Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  25. Kosten und Aufwand • Serologie PCR-SSP Sequenzierung • Aufwand + ++ +++ • Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h) • Kosten (AB0) ca. 4-5 € ca. 7-20 € (inhouse) ca. 40-50 € ca. 30 € (kommerziell) • GOÄ (AB0)3980 5,83 € 3920 52,46 € 3920 52,46 € (3981 10,49 €) 3922 29,14 € 3926 116,57 € • Thermocycler zwischen 3000-7000 € • Photoanlage ca. 2000 € • Gelkammer, Spannungsgerät ca. 700 € • Sequencer ca. 30.000 bis 100.000 € Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  26. Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? Jein • wenn PCR-Austattung für andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfällen auftritt • „Zukunftstechnologie“: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammeln • Kein Ersatz für Serologie Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  27. Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  28. interessante Publikationen: • AB0: • Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ff • Single tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ff • Molecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben) • Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ff • Polymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  29. interessante Publikationen: • Rhesus: • RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ff • Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches Ärzteblatt 2007, 10; 573ff • The Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2; 375ff • Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ff • Molecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ff • RHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ff • RHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  30. interessante Publikationen: • weiteres: • Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ff • Molekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Müller et.al. Deutsches Ärzteblatt 2001, 98/6; 317ff • DNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ff • Quantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ff • The low-incidence MNS antigens Mv, sD, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

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