Monokloniniai antik ū nai ir jų taikymas biotechnologijai ir medicinai Aurelija Žvirblienė, Biotechnologijos institutas

1. Monokloniniai antikūnai ir jų taikymas biotechnologijai ir medicinai Aurelija Žvirblienė, Biotechnologijos institutas

2. Antikūnai – imunoglobulinų klasės baltymai. Jie specifiškai jungiasi su įvairiais antigenais. Antikūnus gamina B limfocitai.

3. Antikūnai - humoralinio imuninio atsako komponentas. Jie cirkuliuoja kraujo plazmoje ir kituose organizmo skysčiuose.

4. Įgytas imunitetas: humoralinis ir ląstelinis Humoralinis: antikūnai Ląstelinis: T ląstelės

5. Antikūnai yra sekretuojami ir membraniniai. Membraniniai – B limfocitų receptoriai.

6. B ląstelių atsakasį baltyminius antigenus: antikūnų sekrecija Humoralinis imuninis atsakas – pirminis, antrinis – skiriasi kiekybiškai ir kokybiškai. Kai antigenas patenka pakartotinai, antikūnų atsakas efektyvesnis.

7. Imunoglobulinai(Ig) skiriasi pagal: MWpI Hidrofilines savybesSedimentacijos greitįTirpumąFunkcijas: specifiškumą, afiniškumą Imunoglobulinų klasės: IgGIgMIgAIgDIgE Polikloninius antikūnus sunku išgryninti.

8. IgG klasės imunoglobulinai sudaro didžiausią Ig dalį (75%) Koncentracija kraujo serume: 10-15 mg/ml

9. Antikūnų efektorinės funkcijos

10. Antigenas – medžiaga, kuri reaguoja su antikūnais Imunogenas - medžiaga, kuri sukelia imuninį atsaką. Stiprūs imunogenai: • baltymai; • virusai. Silpni imunogenai: • polisacharidai; • cheminiai junginiai.

11. Epitopas - sąveikos su antikūnu vieta antigeno molekulėjeLinijiniai ir konformaciniai epitopai

12. B limfocitų repertuaras Kiekvienas B limfocitų klonas gamina unikalaus specifiškumo antikūnus. Antikūnų įvairovė – praktiškai neribota. Jie gali atpažinti 1010 - 1011 skirtingų antigenų (epitopų).

13. Kloninės selekcijos teorija: limfocitų klonai atsiranda iki sąveikos su antigenu. Kaip atsiranda daugybė limfocitų su skirtingais receptoriais? Jeigu kiekvieną receptorių koduotų atskiras genas: tai užimtų didelę genomo dalį. Imunoglobulinų genai susiformuoja iš genų segmentų, vykstant DNR rekombinacijai.

14. Kloninės selekcijos teorija (Burnet, 1899-1985, Jerne, 1911-1994)

15. Antikūnai: • Polikloniniai. Gaunami iš kraujo serumo, atlikus imunizaciją. • Monokloniniai. Gaunami hibridomų technologijos būdu. Taikymas: • Imunocheminė analizė • Diagnostika, biotechnologija • Gydymas

16. Antikūnai yra vertingi diagnostiniai reagentaiImunologiniai analizės metodai – pagrįsti antigeno-antikūno sąveikaPrivalumai:jautrumas specifiškumasPvz., galima nustatyti hormonus kraujo serume, kur jų koncentracija siekia 1 ng/ml.Kitų baltymų (albumino, Ig) – 10-20 mg/ml.

17. Hibridomų technologija: monokloninių antikūnų gavimo būdas G.Köhler, C.Milstein, 1975 Nobelio premija 1984 Köhler G, Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature. 1975 Aug 7;256(5517):495-497

18. Monokloniniai antikūnai: • gaminami vieno B ląstelių klono • atpažįsta vieną epitopą • vienodos fizikocheminės savybės • gali būti gaunami neribotais kiekiais • nesunku išgryninti

19. Hibridomų technologija Gaunamas vienos B ląstelės klonas. Visi jo gaminami antikūnai – vienodi. Etapai: - Imunizacija; - blužnies ląstelės suliejamos su vėžinėm ląstelėm (mieloma): PEG ar kitas suliejimo agentas; - hibridai atrenkami selektyvioje HAT terpėje (hipoksantinas-aminopterinas-timidinas); mielomos ląstelės mutantinės, todėl neišgyvena; - išlieka gyvi tik hibridai; - tikrinamas jų specifiškumas, atrenkami antigenui specifiški hibridai; - hibridai klonuojami, padauginami, užšaldomi. In vitro: galima gauti iki 0.05 mg/ml monokloninių antikūnų. Taikomi diagnostikoje, ląstelių tyrimuose ir kt.

20. Hibridomų technologijos etapai: imunizacija suliejimas selekcija klonų atranka klonavimas klonų padauginimas

21. Hibridomų savybės išlieka 15-20 pasažų. Galima reklonuoti. Antikūnų sekrecijos lygis: in vitro – 10-100 mkg/ml in vivo – 2-10 mg/ml IgG2a/2b lengva išgryninti afininės chromatografijos būdu, naudojant baltymą A

22. Antikūnų gryninimo būdai: • Išsodinimas amonio sulfatu; • Afininė chromatografija su baltymu A; • Jonų mainų chromatografija. IgG elektroforezė poliakrilamido gelyje

23. Monokloninių antikūnų taikymas: - Imunodiagnostikos metodai • Srautinė citometrija (CD antigenai) • Ląstelės biologijos tyrimai • Biofarmacija, rekombinantinių baltymų nustatymas Humanizuoti antikūnai: - Imunoterapija: antikūnai prieš citokinus, vėžinius, virusų antigenus

24. Imunologiniai metodai: Imunodifuzija (nežymėti komponentai) 0,1 mg/ml Radioimuninė analizė (1959 m.) 1 ng/ml Imunofermentinė analizė (1971 m.) iki 10 pg/ml Imunofluorescencija (ląstelių, audinių tyrimai) Imunoblotingas (antigenų kokybinis nustatymas) Srautinė citometrija (ląstelių subpopuliacijų tyrimai)

25. Imunosensoriai Registravimo sistema Signalo vertiklis Biologinė sistema Antigenas Antigeno-antikūno kompleksas Sąveika elektrocheminis signalas Nereikalingas antigeno ar antikūno žymėjimas

26. Fermentinės žymės fermentas • Krienų peroksidazė; • Šarminė fosfatazė; • Beta-galaktozidazė; Prijungimo metodai: • Oksidacija perjodatu • Gliutaro aldehidas • Fermentinių žymių savybės: • stabilumas; • prijungimo būdas; • aukštas fermentinis aktyvumas; • tirpūs chromogeniniai substratai (IFA); • netirpūs chromogeniniai substratai (imunoblotingui, imunohistochemijai). Netiesioginis žymėjimas: Biotinas - streptavidinas

27. Afininė chromatografija Antigeno gryninimas: - ląstelių lizatas praleidžiamas per afininį sorbentą su imobilizuotais antikūnais; - atliekama eliucija (pH)

28. Monokloniniai antikūnai: plačiai naudojami diagnostikoje Imunocheminiai laboratoriniai tyrimai turi diagnostinę ir prognostinę vertę Nustatomi: vėžiniai žymenys kraujo serume (PSA, Her-2 ir kt.) virusų antigenai (HBV, HCV, HIV ir kt.) širdies ir kraujagyslių ligų žymenys (chemokinai, trombogenezės faktoriai ir pan.) tiriamos ląstelių populiacijos (imuninis atsakas) ........ Svarbu: metodų specifiškumas

29. Biotechnologijos institute sukurti monokloniniai antikūnai prieš: • Žmogaus IgG, IgA, IgM • Žmogaus citokinus, hormonus: IL-3, G-CSF, IFN-a, IFN-g, TNF-a, MIF, angiogeniną, antitripsiną, GH, insuliną • Rekombinantinius receptorius: PACAP, Vr, OCT • Virusų baltymus: tymų, kiaulytės, poliomos virusų, hantavirusų nukleokapsidės baltymus • Vėžinius epitopus: Muc1, WT1

30. Hibridomų kūrimui reikalingi stiprūs imunogenai • Rekombinantiniai virusiniai baltymai - į virusus panašios dalelės. • Galima ekspresuoti virusinius baltymus su įterptais vėžiniais epitopais. • Aktyvina: • - B ląsteles; • T ląsteles; • dendritines ląsteles (DC). • Efektyviai patenka į DC, skatina jų brendimą, kostimuliatorių ekspresiją.

31. Monokloniniai antikūnai sudaro didžiausią biologinių produktų rinkos dalį Antikūnų rinka 2006 m. – 12.8 mlrd USD Iš jų biofarmacinių antikūnų – 8 mlrd USD. Kasmetinis augimas15-30%.

32. Biofarmaciniai antikūnai: • Chimeriniai: žmogaus IgG, pelės Ig variabilioji dalis; • Humanizuoti: žmogaus IgG, pelės CDR; • Žmogaus Ig (transgeninės pelės) Imunoterapija: anti-TNF-alfa, anti-CD3, antikūnai prieš vėžinius, virusų antigenus

33. Chimeriniai: žmogaus IgG, pelės Ig Fab fragmentas;Humanizuoti: žmogaus IgG, pelės CDR.Antikūnų fragmentai: scFv (Fv fragmentai, sujungti linkeriu). Nėra Fc dalies, todėl antikūnas neatlieka efektoriaus funkcijų. Humanizuoti ir chimeriniai antikūnai gaunami genų inžinerijos metodais

34. Rekombinantinių antikūnų kūrimas: imunoglobulinų genų bibliotekos; reikalingo geno atranka; antikūnų afiniškumo ir specifiškumo pagerinimas (mutagenezė)

35. Hibridomos Imunizuoto individo B limfocitai Neimunizuoto individo B limfocitai (universalios Ig genų bibliotekos) Imunoglobulinų genų bibliotekų dydis

36. 1890 Imunizacija - polikloniniai antikūnai 1975 Imunizacija - hibridomų technologija-monokloniniai antikūnai 1991 Imunizacija - antikūnų genų bibliotekos-rekombinantiniai antikūnai – bisfecifiniai, bifunkciniai antikūnai

37. Rekombinantinių antikūnų ekspresijos sistemos: bakterijos mielės žinduolių ląstelės augalai

38. Rekombinantinių antikūnų privalumai: bakterijų auginimas yra žymiai pigesnis ir paprastesnis nei hibridomų; galima kurti žmogaus antikūnus, skirtus gydymui; nenaudojami gyvulinės kilmės produktai, todėl išvengiama potencialių patogenų, virusų rizikos; genų inžinerijos metodais galima įvairiai modifikuoti antikūno molekulę, suteikti jai norimas savybes. Trūkumai: blogas tirpumas, žemas stabilumas, nepakankamas afiniškumas antigenui.

39. Ačiū už dėmesį