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Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009

Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009. Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser. INSTAND e. V. HbA1c. Bedeutender Parameter im eine glykierte Form des Hämoglobins spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6 Wochen wider

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  1. Universität SzegedMedizinische Fakultät2009 Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser

  2. INSTAND e. V. HbA1c Bedeutender Parameter im • eine glykierte Form des Hämoglobins • spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6 Wochen wider • Therapieüberwachung • Indikator für Therapieerfolg von Patient und Diabetesklinik Qualitätsmanagement des Diabetes Medizinische Analytik SS 2009

  3. INSTAND e. V. Hämoglobin Medizinische Analytik SS 2009

  4. Amadori - Umlagerung INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

  5. ß-Kette des Hämoglobins INSTAND e. V. Gluc – HbA1cVal – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA0Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Medizinische Analytik SS 2009

  6. Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine INSTAND e. V. VerfahrenPrinziperfasste FraktionenMarkenname Säulenchromatographie Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b (Makrosäule) chromatographie HbA1c Mikrosäule Ionenaustausch- HbA1 chromatographie HPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, Variant II, Diamat chromatographie HbA1c HA8160, L-9100 FPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, chromatographie HbA1c, Aldimin-Form Affinitätschromatogrphie Phenylboratsäule Gesamt-Glyko GHb, IMx II hämoglobin Immunologische z.B. Immun- HbA1c TinaQuant Verfahren turbidimetrie HA1c Dimension Referenzmethode HPLC-ESI-MS HbA1c bzw. HPLC-CE Medizinische Analytik SS 2009

  7. HbA1c Routine-Methoden INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

  8. INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut • Testprinzip: • Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe • Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäule • Elution der HbA1c-Fraktion • Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels Photometer bei 415 nm Medizinische Analytik SS 2009

  9. INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

  10. INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

  11. INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Diagnostische Bedeutung: HbA1c spiegelt die mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8 Wochen wider und ist hiermit wertvoll für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes Mellitus. Die HbA1c-Konzentration kann nach folgender Formel in die mittlere Blutglucose Konzentration (MBG) umgerechnet werden: MBG (mg/dL) = 31,7 x %HbA1c – 66,1 MBG (mmol/L) = 1,76 x %HbA1c – 3,67 Medizinische Analytik SS 2009

  12. INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Referenzbereiche: NGSP IFCC Microsäule (Biocon) Stoffwechselgesunde 4.0 – 6.0 % 2.0 – 4.2 % 4.4 – 6.7 % Diab. Zieleinstellung 6.0 – 6.5 % 4.2 – 4.8 % 6.7 – 7.3 % Überwachungsbereich 6.5 – 8.0 % 4.8 – 6.4 % 7.3 – 9.1 % Therapiebedarf > 8 % > 6.4 % > 9.1 % Für diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse stets im Zusammenhang mit der Anamnese, der klinischen Untersuchung und anderen Untersuchungsergebnissen zu werten. Medizinische Analytik SS 2009

  13. Einführung in die HPLC-MS Analytik

  14. HPLC-MS Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass in den letzten Jahren in der Medizinischen Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Im Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es mit höchster Präzision und Richtigkeit die Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen z.B aus Blut oder Urin. Durch seine gute Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem Probenaufkommen ( „high throughput“) für die Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring) und z.B. für das Neugeborenen-Screening in Routinelabors eingesetzt. HPLC:High Pressure Liquid Chromatography = chromatographisches Trennverfahren MS:Mass Spectrometry = analytisches Detektionsverfahren Medizinische Analytik SS 2009

  15. Chromatographie “Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.) • auf Filterpapier : Papierchromatographie • auf Kieselgel- beschichteten Glas: Dünnschichtchromatographie • über mit Kieselgel-gefüllte Säulen: Säulenchromatographie Medizinische Analytik SS 2009

  16. Chromatographie Ein einfacher Versuch zur Darstellung des Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung: 1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und danach in Alkohol aufgelöst – grüne Lösung 2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück gegeben Blattfarbstoffe in Lösung – 3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die Säule getrennt : gelbe, gelbgrüne, grüne, blaugrüne Medizinische Analytik SS 2009

  17. Chromatographie Detektion: z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor Signal = „Peak“ Medizinische Analytik SS 2009

  18. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie HPLC = High Pressure Liquid Chromatography Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  19. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Lösungsmittelflaschen Entgaser Pumpen Probeninjektor Detektor Säule / Säulenofen Abfall Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  20. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 1: Lösungsmittel wird von den Pumpen angesaugt (blaue und orange Linien) und zum Mischer gepumpt. Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  21. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 2: Gemisch wird zum Probengeber gepumpt (Ventil) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  22. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 3: Probenschleife wird mit Lösungsmittelgemisch gefüllt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  23. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 4 a: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  24. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 4b: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  25. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 5: Probe wird zur Säule transportiert Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  26. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 6: Probenbestandteile verlassen die Säule nacheinander und werden im Detektor angezeigt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

  27. Massenspektrometrie Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglicht, Komponenten in komplexen Mischungen zu identifizienen und quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Analyte ionisiert in die Gasphase überführt und nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert detektiert. Medizinische Analytik SS 2009

  28. Aufbau eines Massenspektrometers IonenquelleMassenanalysator GC/MS: EI, CI Quadrupole LC/MS: ESI, APCI, APPI Ion trap Biomolecules: MALDITime of Flight Triple Quadrupole Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

  29. Ion transport Ion filtering Fragmentation Ion filtering Ion detection Triple Quadrupole System Ion production Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

  30. Triple Quadrupole System Schritt 1: Ionen-Erzeugung im ESI-Interface Ion production Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

  31. Electrospray Ionization (ESI) Verbindet HPLC mit MS: Überführung des Analyten flüssig → gasförmig Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

  32. Triple Quadrupole System Schritt 2: Ionen-Transport vom ESI-Interface ins MS Ion transport Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

  33. - + + + - Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

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