Funkcije proteinov

1. Funkcije proteinov • Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) • Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) • Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen ...) • Kontraktilni proteini • Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko bioloških membran • Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze ...) • Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Ig) • Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2. Biosignaliziranje/prenos signala (“signal transduction”) informacija (molekula iz okolja ...) celica z receptorjem celični odziv (kemični proces)

3. Biosignaliziranje • Biološki signali so zelo raznoliki (nekaj primerov:antigeni, oligosaharidi, signali razvoja, komponente EM, rastni faktorji, hrmoni, svetloba, mehanski dotik, nevrotransmiterji, hranila, dišeče molekule, feromoni ...) • Celični odgovori so različni • Celice imajo le nekaj mehanizmov prenosa in spreminjanja signalov (signal transduction) • Mehanizmi signaliziranja so evolucijsko ohranjeni • Primeri signaliziranja - prenos živčnih signalov - odziv na hormone in rastne faktorje - zaznava slike (vid), vonja (voh), okusa - uravnavanje celičnega cikla

4. Značilnosti prenosa signala • Specifičnost: molekulska komplementarnost med molekulo-signalom in receptorsko molekulo • Ojačenje signala • Izguba občutljivosti (“desensitization”) - prilagoditev na signal (“adaptation”) • Integriranje signalov

5. Specifičnost interakcije signalne molekule z receptorjem Specifičnost vezave: – signalna molekula in vezavno mesto na receptorju sta komplementarna – selektivna vezava – visoka afiniteta → Kd<10-9 M Rec + S1 ↔ Rec·S1Kd1 Rec + S2 ↔ Rec·S2Kd2 Kd1 < <Kd2 S1 – molekula, komplementarna z vezavnim mestom receptorja S2 – molekula, ki ni komplementarna z vezavnim mestom

6. Ojačenje signala: encimska kaskada Ojačenje signala lahko poteče za nekaj redov velikosti v msek

7. Izguba občutljivosti/prilagoditev (“desnzitisation/adaptation”) Aktivacija receptorja sproži povratni odgovor, ki “zapre” receptor ali ga odstrani s celične površine (endocitoza)

8. Seštevanje (integration) signalov Če imata dva dražljaja nasprotni učinek na metabolične karakteristike, npr. koncentracija sekundarnega obveščevalca [X] ali membranski potencial Vm , je končni učinek (odziv) vsota obeh dražljajev na receptor 1 in receptor 2 odgovor

9. Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3 Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

10. 1. ionski kanalčki z zaporo (npr. nikotinski receptor, acetilholinski receptor) 2. membranski receptorski encimi (npr. receptor za inzulin) 3. membranski receptorji, povezani z G proteini (npr receptor za adrenalin) 4. jedrni receptorji (vežejo steroidne hormone, tiroidne hormone in vitamin D) delujejo kot transkripcijski faktorji 5. membranski receptorji, ki privlačijo in aktivirajo topne proteine (npr. proteinske kinaze) iz citoplazme 6. adhezijski receptorji, ki posredujejo informacijo med ekstracelularnim matriksom in citoskeletom 6 splošnih vrst mehanizma prenosa signala:(nadaljevanje)

11. Primeri mehanizma prenosa signala: 1. ionski kanalčki z zaporo Ionski kanalčki so osnova za električno signaliziranje vzdražnih celic - ionski kanalčki, odvisni od napetosti primer: Na+ kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah - ionski kanalčki, odvisni od liganda primera: nikotinski receptor acetilholinski receptor

12. Transmembranski električni potencial • K+Na+ATPaza ustvarja • transmembranski potencial • -60 mV depolarizacija hiperpolarizacija depolarizacija depolarizacija (b) Ioni težijo h gibanju v smeri elektrokemijskega gradienta skozi polarizirano membrano- spremembe transmembranskega potenciala Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

13. Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na+ kanalček v živčnih in v živčno-mišičnih sinapsah • Na+ kanalčki so selektivni (K+ in Ca2+ 100 x slabše prehajata) • Hitrost pretoka > 107 ionov/sek • Kanalčki se odprejo kot odziv na zmanjšanje membranskega potenciala (“voltage-gated”) • Hitro se inaktivirajo • Kanalček sestavlja membranski protein (1 840 ak ostankov)

14. Primer: ionski kanalček, odvisen od napetosti: Na+ kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo α-podenota kanalčka – domene I, II, III, IV Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

15. Na+ kanalček nevrona, uravnavan s transmembransko napetostjo Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

16. Primer: ionski kanalček, odvisen od liganda:nikotinski acetilholinski receptor • Receptor je bistvena komponenta električnega signala, ki se prenese od motoričnega nevrona do mišičnega vlakna (v živčno-mišični sinapsi) • Naravni ligand – acetiholin (ACh) (ligand je tudi nikotin) • Vezava ACh na receptor povzroči konformacijsko spremembo receptorja → odpre se ionski kanalček • Kationi prehajajo v notranjost celice → depolarizacija membrane • Ionski kanalček je prepusten za Na+, Ca2+ in K+ • Na+ prehaja v smeri nižje konc. (2 x 10-7 ionov/s)

17. Primer, ionski kanalček, odvisen od liganda: acetilholinskega receptorja - Podenote: 2α, β, γ, δ; na α podenotah vezavno mesto za ACh Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

18. Konformacijska sprememba ionskega kanalčka po vezavi acetilholina (AcH) Polarni ak ostanki Leu zaprt ionski kanalček hidrofobni –R ak levcin preprečuje pretok ionov odprt ionski kanalček – konformacijska sprememba hidrofobni –R ak levcina se je umaknil, v notranjost kanalčka se izpostavijo polarne ak Leu Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

19. Tri stanja ACh receptorja Neaktivno (mirovanje) Aktivno (aktivacija) Neobčutljivo (desenzitizacija) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

20. Prenos živčnega impulza hiperpolarizacija • - Električni impulz (akcijski • potencial) potuje od živčne • celice po aksonu preko • sinaps do naslednje celice • - Tri vrste ionskih kanalčkov, • odvisnih od napetosti: • Na+, K+ in Ca2+ kanalčki • - Na+ in K+ kanalčki se zaporedno • odpirajo - enosmerna • depolarizacija membrane • - Ca2+ kanalčki se odprejo, • Ca2+ sproži eksocitozo ACh • - ACh se sprosti v sinaptično režo, • aktivira Na+ / Ca2+ kanalčke • na postsinapričnem nevronu ... • acetilholin-esteraza (AChE) • katalizira hidrolizo AChE → • utišanje signala depolarizacija dve vrsti kanalčkov: -odvisni od napetosti -odvisni od liganda

21. Utišanje signala:razgradnja liganda acetilholina (ACh) zencimom acetilholin-esterazo ↔ + H2O CH3COOH + HOCH2CH2N+(CH3)3 ocetna kislina holin acetilholin

22. Naravni strupi, ki delujejo na ionske kanalčke – interferirajo s prenosom živčnega impulza • Tetrodotoksin (riba), veže se na Na+ kanalčke in prepreči prenos impulza • Saksitoksin (dinoflagelati v južnih morjih), veže se na Na+ kanalčke • Dendrotoksin (mamba – afriška kača) inhibira K+ kanalčke • Tubokurarin, (aktivni strup kurare-ja, s katerim so ob Amazonki zastrupljevali puščice), veže se na ACh receptor • Kobratoksin in bungarotoksin (kačja strupa), vežeta se na ACh-receptor z visoko afiniteto (Kd = 10-15 M) in inhibirata prenos impulza

23. Strukture nekaterih naravnih strupov, ki inhibirajo ionske kanalčke Tetrodotoksin

24. Bolezni, ki izvirajo iz okvar ionskih kanalčkov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

25. Nevroni vsebujejo ionske kanalčke, ki se odzivajo na različne nevrotransmiterje – primeri: nevrotransmiter ionski kanalček

26. Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3

27. Primeri mehanizma prenosa signala: 2. membranski receptorski encimi – receptor za inzulin inzulinski receptor – tetramer 2α, 2β zunajcelični del α – vezavno mesto za inzulin znotrajcelični del β – kinazna encimska aktivnost, sledi fosforilacija subatrata IRS in nadaljnje interakcije med proteini Tyr Po vezavi inzulina se izvrši avtofosforilacija inzulinskega receprtorja na Tyr  podenote znotraj celice Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

28. Aktiviranje inzulinskega receptorja – tirozinske kinaze z avto-fosforilacijo→sprememba konformacije Neaktivna domena tirozinske kinaze Aktivna domena – 3 tyr ostanki fosforilirani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

29. Osnovni učinki inzulina • Hitri (sekunde): pospešen transport glukoze, ak in K+ v celice, občutljive na inzulin • Srednje hitri (minute): - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje glikogena - stimulacija sinteze, inhibicija razgradnje proteinov - stimulacija razgradnje, inhibicija sinteze glukoze • Zapozneli (ure): povišana koncentracija encimov, ki sintetizirajo lipide inzulin

30. Inzulin uravnava prenos prenašalca glukoze v miocitu (hitri učinek inzulina) Nelson DL, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

31. Uravnavanje ekspresije gena z inzulinom (počasni učinek) IRS-1 insulin receptor substrat adaptorski protein kinaze inzulinski receptor Raf MEK ERK Ras G protein transkripcijski faktor trankripcija genov, ki kodirajo encime, vključene v metabolizem glukoze Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

32. Evkariontske celice: 6 splošnih vrst mehanizmov prenosa signala 4 2 1 6 5 3

33. Primeri mehanizma prenosa signala: 3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini Sestavine signaliziranja preko receptorjev, sklopljenih z G proteini • Receptor s 7 transmembranskimi α-vijačnicami zazna signalno molekulo S • Protein, ki veže gvanozinski nukleotid - heterotrimerni G protein (podenote Gα, Gβ, Gγ) • Encim v membrani, ki katalizira reakcijo nastanka sekundarnega obveščevalca, npr. adenilatna ciklaza (AC) → cAMP, fosfolipaza C (PLC) → IP3 S encim produkt - sekundarni obveščevalec substrat

34. 3. membranski receptorji, sklopljeni z G proteini - ojačenje signala (kaskadna reakcija) AC, PLC ... G protein receptor cAMP, cGMP ... fosforilacija • Vezava signala na receptor aktivira več molekul G proteinov • Vsaka G podenota aktivira več encimov (efektorjev) • Vsak encim katalizira nastanek več molekul sek. obveščevalcev • Vsak sek. obveščevalec aktivira več encimov kinaz • Vsaka kinaza fosforilira (aktivira) več encimov, vlkjučenih v določeno • metabolično pot aktivni encimi

35. 3. membranski receptorji, povezani z G proteini • cAMP, cGMP - delovanje nekaterih hormonov, npr. adrenalin - delovanje svetlobe (molekulske osnove vida) - delovanje dišečih molekul (molekulske osnove vonja) - delovanje okusnih molekul (molekulske osnove okusa) • diacilglicerol (DAG), inozitol-3-fosfat (IP3) in Ca2+ Sekundarni obveščevalci, si se sintetizirajo po aktivaciji G-proteinov - nekaj primerov

36. Primer signaliziranja preko G proteinov: signal adrenalin β-adrenergični receptor veže adrenalin → cAMP → aktivirana proteinske kinaze → aktivirana metabolična pot (razgradnja glikogena) kot celični odgovor Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

37. Nastanek sekundarnega obveščevelca cAMPATP → cAMP + PPi ATP cAMP

38. Utišanje signala, ki ga je sprožil adrenalin in ki deluje preko cAMP • Hidroliza cAMP s fosfodiesterazo • Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote • Desenzitizacija receptorja z arestinom 1. hidroliza cAMP s fosfodiesterazo cAMP adenozin 5‘-monofosfat (AMP)

39. 2. Hidroliza GTP z endogeno GTPazno aktivnostjo Gα podenote Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

40. 3. Desenzitizacija signaliziranja β-adrenergičnega receptorja z arestinom -adrenergična arestinska kinaza (-ARK) arestin endocitoza Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

41. Signali, ki uporabljajo cAMP kot sekundarni obveščevalec • Kortikotropin • Adrenalin • Glukagon • Histamin • Lutenizirajoči hormon • Dišeče molekule • Prostaglandini • Somatostatin • Molekule okusa • Hormon, ki stimulira • ščitnico kortikotropin Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

42. Primer signaliziranja preko G proteinov Inozitol-3-fosfata (IP3) kot sekundarni obveščevalec Aktiviranje fosfolipaze C (PLC) s hormonom in delovanje IP3 na ionske kanalčke za Ca2+ v membrani endoplazmatskega retikuluma Encim: fosfolipaza C Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

43. Dražljaji, ki se prenašajo preko fosfolipaze C in IP3 • Peptid, ki sprošča gastrin • Glutamat (signaliziranje v možganih) • Gonadotropin-sproščujoči hormon (hipofiza) • Histamin • Oksitocin • Vazopresin • Serotonin • Tirotropin-sproščujoči hormon

44. Kalmodulin – proteinski posrednik pri mnogih encimskih reakcijah, ki jih stimulira Ca2+ Aktivnost nekaterih proteinov uravnavata Ca2+ in kalmodulin • Adenilil-ciklaza (možgani) • Ionski kanalčki za Ca2+ v sarkoplazmatskem retikulumu • cAMP fosfodiesteraza • Ionski kanalčki, odvisni od cAMP pri sprejemanju vonja • Miozinske kinaze • Sintaza NO • Ca2+ ATPaza v plazemski membrani Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

45. Primer signaliziranja preko G proteinov:Sprejem svetlobe v očesu vretenčarjev Struktura očesa

46. Struktura paličnic diski

47. Protein rodopsin v membrani diska citosol notranjost retinal

48. Indukcija hiperpolarizacije celic paličnic s svetlobo → → → razgradnja cGMP → zaprtje ionskih kanalčkov aktiviranje s svetlobo stanje mirovanja Paličnica, za svetlobo občutljiva čutna celica v mrežnici, ki sestoji iz paličke, perikariona in nevrita Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

49. Interakcija med rodopsinom (receptor za svetlobo) in transducinom (G protein) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

50. Vitamin A in njegovi produkti izomerizacija 11-cis-retinala v trans retinal pod vplivom svetlobe - prvi v zaporedju dogodkov v vidnem ciklu → konformacijska sprememba rodopsina ...