Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos

1. Transferencia de material genético II: Transformación Estructura, propiedades y función de ácidos nucleicos Pérez Reséndiz Enrique Leonardo

2. Ingeniería genética • Es una herramienta que permite la manipulación del material genético in vitro. • Se sustenta en técnicas que permiten aislar, caracterizar y manipular DNA. • Para la generación de un organismo genéticamente modificado se tienen que hacer algunas consideraciones.

3. Ingeniería genética • Enzimas fundamentales: • Endonucleasas de restricción • Ligasas • Fosfatasas • Cinasas • Polimerasas • Transcriptasa reversa • Helicasas

4. Vectores de clonación • Es un sistema que permite introducir en una célula hospedera un fragmento de DNA que se pretende clonar. • Los vectores permiten obtener múltiples copias de un trozo de DNA.

5. Vectores de clonación • Replicación independiente (ori*): Sirve para la replicación autónoma e independiente del genoma del hospedero. • Sitios de corte únicos: Permite la apertura del DNA (enzimas de restricción), denominado sitio múltiple de clonación • Marcador de selección: Permiten aislar a las células hospederas con el vector (genes de resistencia a antibióticos). • *Recuperación sencilla. • *Promotores fuertes.

6. Vector recombinante • Molécula del DNA del vector con DNA de interés. • Para la unión del DNA de interés se utilizan ligasas.

7. Transformación

8. Transformación • Para la introducción del DNA existen diferentes técnicas: • Choque térmico. • Microelectroporación.

9. Choque térmico • Las bacterias hospederas son pre-tratadas con agentes que aumentan su permeabilidad membranal, como la temperatura y los iones. • Los iones como el Ca2+, disminuyen la repulsión de cargas eléctricas entre los nucleótidos y la membrana, facilitando la entrada del plásmido al interior de la célula.

10. Células competentes o células transformantes • Las células que recibieron un tratamiento apropiado para llevar a cabo la introducción del material genético se les denomina células competentes. • Las células transformantes son las células competentes que se les introdujo el material genético, a las cuales se les restauro su permeabilidad de la membrana y se encuentran en condiciones óptimas de crecimiento.

11. Objetivos • Conocer el fundamento para transformar células bacterianas. • Realizar la técnica de transformación bacteriana. • Aprender a identificar células transformantes mediante su fenotipo. • Conocer la definición de organismo transgénico. • Conocer las aplicaciones de la transformación bacteriana: beneficios y riesgos.

12. Material • Células competentes de E. coli. • Plásmido PET-TEM-1: • Vector recombinante pET-TEM-1-ompAβ-lactamasa. • Cajas Petri con medio LB/Kanamicina (30 µg/mL). • Medio SOC. Medio Luria adicionado con 20mM Glucosa.

13. Desarrollo experimental • Transformación de células competentes con el vector PET-TEM-1 por el método de choque térmico. • Añadir 1 a 5 µL del plásmido en el tubo de las células de E. coli competentes. • Mezclar. • Dejar en hielo por 30 minutos. • Dar choque térmico a 42ºC durante 45 segundos (NO AGITAR).

14. Desarrollo experimental • Agregar 450 µL de medio SOC e incubar por 60 minutos a 37ºC con agitación 225 a 250rpm. • Concentrar las células por centrifugación. Eliminar el sobrenadante y resuspender el paquete celular en 100 µL de medio SOC. • Esparcir los 100 µL de bacterias transformadas, en las cajas con medio de selección (Agar -LB-Kanamicina).

15. Desarrollo experimental • Incubar a 37ºC por 24 h. Observar crecimiento y guardar la caja a 4ºC. • Como control negativo incubar 100 µL de células competentes en medio de selección a 37ºC por 24 h. • Calcular la eficiencia de la transformación.

16. Resultados • Se utilizara como indicador la resistencia a Kanamicina. • Las células que crecen en el medio Agar -LB-Kanamicina, son las células transformantes.

17. Resumen

18. Examen • Qué es un vector de clonación y da las tres características? • Da el nombre del método que se usará para la transformación • Y explica en que consiste • Que diferencia hay entre conjugación y transformación

19. Gracias por su atención FIN