1 / 55

Inhoud presentatie

Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A.J. Kluijtmans Lab. Genetische , Endocrine en Metabole Ziekten UMC St Radboud. Inhoud presentatie. Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten (Klein beetje) biochemie Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten

ely
Download Presentation

Inhoud presentatie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Laboratoriumdiagnostiek van cystinedr. Leo A.J. KluijtmansLab. Genetische, Endocrine en MetaboleZiektenUMC St Radboud

  2. Inhoud presentatie • Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten • (Klein beetje) biochemie • Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten • Meting cystine (eigenlijk: cysteine) • Hoe kunnen we elkaar vinden • Vragen

  3. Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten • Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten) • Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek • 8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen) • Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar

  4. Het UMC St Radboud, Nijmegen

  5. LGEM laboratorium

  6. LGEM laboratorium

  7. De humane cel Lysosoom Celmembraan Mitochondrion Endoplasmatischreticulum Cytoplasma Kernmembraan Kernporie Kern Kernlichaampje Ribosoom Golgi-systeem.

  8. Het lysosoom • Ontdekt in 1949 door Christian de Duve • De stofzuigers van de cel • Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal) • Afbraakproducten gaan naar cel plasma • Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

  9. De belangrijkste spelers • Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( ) NH2 • Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH ( ) NH2NH2 • Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( ) COOH • Cysteamine-cysteinedisulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH ( ) NH2

  10. Hoe gaat het ‘normaal’? cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel

  11. WatgebeurterbijCystinosis cystine cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

  12. WatgebeurterbijCystinosis cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

  13. Werking van cysteamine Cystìne-transporter cysteamine Cysteine-transporter cysteine Lysine-transporter Lysosoom De cel

  14. Diagnose cystinosis • Cystine stapelt in lysosoomtgv het transporter defect • Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten) • Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten • DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

  15. Wat zijn de ‘challenges’ • Isolatie granulocyten uit bloed • Vermijden contaminatie met andere bloedcellen (mn rode) • Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine • Oxidatie van cysteine geeft cystine • Rode- en witte bloedcellen bevatten veel cysteine

  16. Granulocyt isolatie (polymorphonucleaire cellen)

  17. Leukocyt isolatie, procedure • Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden • Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

  18. Dextraan incubatie, 1 uur op ijs Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

  19. Het leukocyten isolaat Totaal: 4.4-11.0 x 109 per liter granulocyten

  20. Dextraan incubatie Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

  21. Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie • Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker). • Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen) • Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm) • Scheiding op soortelijk gewicht

  22. De Centrifuge

  23. De Ficollgradient lymfocyten granulocyten Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

  24. Contaminatie met rode bloedcel • Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving • Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten • + 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

  25. Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten • De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS). • Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g • Afzuigen wasbuffer en invriezen in vloeibare stikstof (-196°C) • Opslag in -80°C vriezer tot analyse

  26. Meting cystine uit de granulocyt met HPLC

  27. HOOC HC-CH2-SH NH2 Wat is de situatie ? cysteine Andere –SH verbindingen Lysosoom cystine De cel

  28. Cellen kapot maken

  29. Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij… Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine Vals verhoogd cystine

  30. De oplossing… • N-ethylmaleimide (NEM) Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.acysteine)

  31. Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( ) + NEM in overmaat Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook het aanwezige cysteine weg Het bindt NIET aan cystine

  32. Complex mengsel van verbindingen Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

  33. Complex mengsel van verbindingen

  34. Het complexe mengsel • In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen. • De overmaat aan NEM is weggevangen en kan gééncysteine meer binden • Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten. • Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

  35. Complex mengsel van verbindingen Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

  36. Cysteine meting met HPLC • HPLC: High Performance LiquidChromatography (hogedruk vloeistof chromatografie) • Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

  37. Hoe werkt HPLC?

  38. De ‘cystine’ HPLC in het lab.

  39. De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden

  40. De vloeistoffen

  41. De monster verwisselaar van de HPLC

  42. Cysteine kwantificeren • Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen. • Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

  43. Chromatogram Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

  44. Van piekoppervlak naar concentratie Oppervlakte piek Hoeveelheid cysteine In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald. Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µM

  45. Van cysteine concentratie naar uitslag • Oppervlak ~ Concentratie cysteine • Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine) • Cysteine concentratie wordt gehalveerd. • Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen. • Uitslag is xxnmolcystine / mg eiwit.

  46. Referentiewaarden / Targetwaarden • In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s) • Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten) Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld: Ouders zijn drager maar hebben géénklachten.

  47. Wat bieden we aan in 2011? • Kinderpoli: 11-01-2011 • Volwassenen: 17-01-2011 • Kinderpoli: 25-01-2011 • Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01) • Kinderpoli: 12-04-2011 • Volwassenen: 18-04-2011 • Kinderpoli: 26-04-2011 • Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04) • Kinderpoli: 14-06-2011 • Kinderpoli: 21-06-2010 • Volwassenen: 27-06-2011 • Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06) • Volwassenen: 26-09-2011 • Kinderpoli: 11-10-2011 • Kinderpoli: 25-10-2011 • Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

More Related