DNA metabolisme

1. DNA metabolisme Winnie Eskild, IMBV 2004

2. DNA metabolisme • DNA metabolisme omfatter: replikasjon, reparasjon og rekombinasjon • DNA bærer koden/oppskriften for en organisme og må forbli korrekt • DNA er det eneste makromolekyle som har sitt eget reparasjonssystem som tar seg av alle de forskjellige typer skade DNA utsettes for • E. colis reparasjonsgener er godt undersøkt

3. E. coli DNA- reparasjonsgener

4. Nomenklatur • Bakteriegener gis trebokstavnavn etter deres funksjon • Gennavnene skrives med små skråstilte bokstaver • Eksempel: dna er genet for DNA replikasjon og rev er genet for DNA rekombinasjon • Flere gener for samme funksjon gis samme navn etterfulgt av en stor bokstav: dnaA, dnaB, dnaC, dnaE Bokstaven forteller oftest i hvilken rekkefølge genene ble oppdaget • Når genproduktet er et protein brukes samme navn og første bokstav skrives stort: genet dnaA koder for proteinet DnaA

5. Replikasjon • Den kopieringen av DNA som finner sted ved celledeling må være svært nøyaktig • Naturen har utviklet en unik prosess med denne egenskapen • Alle levende organismer kopierer sitt DNA på samme måte • Systemet med at DNA er sin egen backup kopi er genialt og gjør det svært motstandsdyktig overfor skade • DNA replikasjonen er semikonservativ og drar dermed full fordel av at de to DNA-trådene er komplementære • Semikonservativ replikasjon betyr at de to dattercellenes DNA består av en tråd fra modercellen og en nysyntetisert tråd

6. Meselson-Stahl eksperimentet • Bakterier ble grodd i mange generasjoner i næringsmedium med 15N i form av NH4Cl som eneste N-kilde • Analyse av DNA på CsCl-gradient viste et ”tungt” bånd. • Bakteriene ble overført til medium med 14N som eneste N-kilde. Vokste til bakteriene hadde delt seg én gang, dvs én replikasjon

7. Meselson-Stahl eksperimentet • Analyse av DNA på CsCl-gradient viste et noe ”lettere” bånd. Dette er tegn på at den ene av DNA-trådene er lett og den andre tung • Bakteriene fikk vokse til de hadde delt seg én gang til • Analyse av DNA på CsCl-gradient viste ét bånd som på forrige gradient og ét ”lett” bånd

8. John Cairns eksperiment • Hvordan foregår den semikonservative replikasjonen? • John Cairns lot bakterier vokse i medium med 3H. Isolerte DNA og eksponerte det til røntgenfilm • Resultatet viste en bobbel som ble større og større • Dette viste at replikasjonen starter på ét definert sted og beveger seg i begge retninger samtidig. Begge DNA-trådene replikeres altså samtidig og de skilles først umiddelbart før replikasjonen • Hver ende av replikasjonsboblen kalles en replikasjons-gaffel • Det ble senere vist at replikasjonen alltid starter på samme sted, origo

9. Replikasjonen starter på ét definert sted og beveger seg i begge retninger samtidig

10. DNA • DNA tråden har retning • 5’-enden har fri fosfatgruppe • 3’-enden har fri OH-gruppe • Nukleotidenes ribosedeler er koblet sammen med fosfodiesterbindinger • Basene er koplet til ribosens C-atom nr.1

11. DNA og hydrogenbindinger Adenin kan danne 2 hydrogenbindinger til thymin Guanin danner 3 hydrogenbindinger til cytosin Hydrogenbindingene er de eneste kreftene som holder de to DNA-trådene sammen Hydrogenbindingene er basis for komplementariteten mellom de to DNA-trådene Hvis den ene tråden har flg. sekvens: 5’-GTCATCTGAC-3’ har den andre 3’-CAGTAGACTG-5’

12. DNA og hydrogenbindinger • De to DNA-trådene er antiparallelle: 5’ 3’ 3’ 5’ 2 hydrogen-bindinger mellom A og T 3 hydrogen-bindinger mellom C og G

13. DNA syntetiseres i 5’ 3’ retning • DNA syntese kan bare foregå i 5’-3’ retning • Templattråden avleses i 3’-5’ retning • DNA-trådenes antiparallellitet medfører at den ene DNA-tråden kopieres kontinuerlig mens den andre tråden kopieres diskontinuerlig • Leading strand syntetiseres kontinuerlig • Lagging strand syntetiseres diskontinuerlig 3’ 5’ 3’ 5’ Okazaki fragment

14. Okazaki fragmenter • I bakterier: 1000-2000 nukleotider • Hos eukaryoter: 150-200 nukleotider

15. Polymerase reaksjonen • Nukleotider selekteres ved hjelp av baseparring • De koples til 3’-enden av polynukleotidet • 3’-OH-gruppen retter et nukleofilt angrep mot a-fosfatgruppen i innkommende nukleotid • Det dannes en fosfodiesterbinding mellom polynukleotidet og det nye nukleotidet. Pyrofosfat spaltes fra • Reaksjonen drives frem av • hydrolyse av pyrofosfat 2) baseparring og base ”stacking”

16. DNA polymerasenes egenskaper • Bakterier har minst 5 forskjellige polymeraser som er spesialisert på forskjellige polymerase reaksjoner • DNA polymeraser danner en fosfodiesterbinding mellom 5’-fosfo-gruppen på innkommende nukleotid og 3’-OH-gruppen på 3’-enden av eksisterende polynukleotid • DNA polymeraser kan bare forlenge eksisterende polynukleotider • DNA polymerasenes egenskaper: 1) polymeraser trenger en templat 2) polymerase må ha en primer 3) alle polymeraser leser korrektur i 3’-5’ retning og har 3’-5’-eksonuklease aktivitet 4) noen polymeraser har 5’-3’- eksonuklease aktivitet

17. E. coli polymerase I, II og III

18. E. coli polymerase funksjoner Polymerase I • Utgjør mer enn 90% av total polymerase aktivitet • Er ansvarlig for reparasjon og rekombinasjon • Har 5’-3’ eksonukleaseaktivitet. Denne fjerner DNA/RNA fragmenter og setter inn nye Polymerase II • Reparerer skader på DNA Polymerase III • Er hovedansvarlig for replikasjonen

19. Eksonukleaser og endonukleaser • Eksonukleaser kutter bort nukleotider fra enden av et polynukleotid, enten fra 5’-enden ( 5’-3’-ekso-nukleaser) eller fra 3-’enden (3’-5’-eksonukleaser) • Endonukleaser kutter inne i polynukleotidene. Noen kutter litt vilkårlig andre kutter ved klart definerte sekvenser. En viktig gruppe er restriksjonsnukleasene 5’-3’-eksonuklease 3’-5’-eksonuklease 5’3’ 3’ 5’ endonuklease

20. Pol. I erstatter RNA-primere med DNA • Primere ved start av leading strand eller Okazaki fragmenter fjernes ved hjelp av pol. I 5’-3’-eksonukleaseaktivitet. • Samtidig syntetiserer pol. I et nytt fragment ut fra templat-sekvensen • Et annet enzym trengs for å lage fosfodiesterbindingen mellom det nyinnsatte fragmentet og eksisterende DNA-polymer, DNA ligase

21. Klenow fragmentet • Polymerase I består av ét stort polypeptid, MW 103 kDa • Pol. I kan spaltes i to fragmenter ved lett protease behandling • Det minste fragmentet inneholder 5’-3’-ekso-nukleaseaktiviteten • Det største fragmentet, Klenow fragmentet inne-holder de andre pol. I aktivitetene, polymerisering og 3’-5’-eksonuklease-aktiviteten • Klenow er mye brukt innen bioteknologien

22. Korrekturlesing • Polymerase I leser korrektur på inkorporerte nukleotider og fjerner feil • Pol. I har eget sete for korrekturlesing • Dette sete fjerner også feil nukleotid • Polymerasesetet setter deretter inn den korrekte nukleotid

23. Polymerase III er stort og komplekst

24. Polymerase III • Polymerase III øker sin prosessivitet ved hjelp av b-subenheten (DnaN). • Denne danner en ring som holder pol. III fast på templaten • Pol. III kopler over 500.000 nukleotider før den faller av

25. Replikasjon krever mange enzymer • I E. coli trengs over 20 forskjellige enzymer, hver med sin spesifikke oppgave • Samlet kalles alle disse enzymene for et replisom eller DNA replikase system • Helikaser: separerer DNA-trådene • Topoisomeraser: avhjelper topologisk stress (knutedannelse) • DNA-bindende proteiner: forhindrer at DNA-trådene hybridiserer dvs danner hydrogenbindinger • Primaser: syntetiserer RNA-primere hvor DNA- polymerasene kan fortsette • DNA polymeraser: syntetiserer DNA • DNA ligaser: lukker igjen DNA tråden etter fjerning av RNA-primerne

26. Replikasjon består av tre faser • Initiering: • Origo identifiseres, DNA-trådene separeres, primer syntetiseres, • Elongering: • DNA-syntese av leading og lagging strand • Terminering: • Møte med Ter-Tus komplekset og frigjøring av de to nye kromosomene fra hverandre

27. E. coli replikasjon: initiering • Initiering finner sted ved origo, oriC, en høyt konservert basesekvens på 245 bp • To viktige sekvensmotiver: • 9 baseparmotivet TTATCCACA gjentas 4 ganger i forskjellig retning • 13 baseparmotivet GATCTNTTNTTT gjentas 3 ganger samme retning • Minst 9 forskjellige proteiner deltar i initieringen

28. DnaA (ca 20 stk) binder seg til de fire 9-basepar motiver • Dette fører til separering av DNA-trådene i 13-basepar motivene. Her hjelper proteinet HU og ATP leverer energien

29. To komplekser med hver seks molekyler DnaB (helikase) binder seg til hver av de separerte DNA-trådene. Her hjelper DnaC • DnaB åpner replikasjonsboblen og etablerer en replikasjonsgaffel i hver ende • ”single strand binding proteins” eller enkelttråd-bindende proteiner binder seg til DNA-trådene • DNA gyrase avhjelper topologisk stress

30. Initiering er en regulert prosess • Initiering av replikasjonen er regulert slik at den bare forekommer én gang i hver cellesyklus • Det eneste trinn i replikasjonen som reguleres er initieringen • Reguleringsmekanismen er ennå ikke helt klarlagt • Metylering av oriC spesielt, men også resten av E.coli kromosomet inngår • Kopling til cellemembranen bidrar også til regulering

31. Elongering av leading strand • Elongering av leading strand er en kontinuerlig prosess • DnaG (primase) syntetiserer en RNA-primer på 10-60 nukleotider. Den er komplementær til templaten men fjernes senere • Polymerase III fester seg til templaten og kopler sammen nukleotider basert på templatsekvensen

32. Elongering av lagging strand Prinsipielt lik syntese av leading strand men den foregår i motsatt retning av åpningen av replikasjonsgaflen Med 1-2 X 103 basers avstand lager primo-somet en primer og pol. III syntetiserer DNA-tråden frem til forrige primer Primosomet er en egen enhet av helikase og primase innen replikasjonkomplekset Replikasjonskomplekset syntetiserer altså begge trådene samtidig

33. Replikasjonskomplekset • Replikasjonskomplekset inneholder to polymerase III, en til hver av DNA-trådene • Lagging strand legges i en løkke gjennom replikasjons- • komplekset slik at syntesen av denne tråden holder tritt med leading strand • Komplekset antas å være festet til cellemembranen og DNA føres gjennom for replikasjon • Resultatet er rask koordinert syntese • Ca. 1000 nukleotider per sekund koples sammen på hver tråd

34. Lagging-strand legges i en løkke tilbake gjennom replisomet. Herved kan leading og lagging-strand syntetiseres i samme retning. SSB binder til enkeltrådet DNA

35. Helikase tvinner opp DNA-tråden samtidig som primase syntetiserer en RNA-primer. Polymerase syntetiserer Okazaki fragmentet

36. Når polymerase møter forrige Okazaki fragment slipper den taket

37. Polymerasen leter nedover lagging-strand til neste primer og setter igang syntese av neste Okazaki fragment

38. Okazaki fragmentene samles • DNA polymerase I bruker sin 5’-3’ eksonuklease aktivitet til å fjerne RNA-primeren • Pol. I syntetiserer en DNA tråd i primerens sted • Deretter lukker DNA ligase åpningen i DNA-tråden. Denne reaksjon krever ATP/NAD+

39. DNA ligase reaksjonen • Ligasen må først aktiveres • Aktivering skjer ved påkopling av AMP enten fra ATP (virus og eukaryoter) eller NAD (bakterier) • AMP koples til en e-NH2-gruppe på enzymet

40. DNA ligase reaksjonen • Ligase overfører AMP til 5’-fosfatgruppen • 3’-OH-gruppen retter deretter et nukleofilt angrep mot 5’-fosfatgruppen og det dannes en fosfodiesterbinding. Energimessig fordelaktig, her spaltes en anhydridbinding og det dannes en fosfodiesterbinding

41. Proteinene ved replikasjonsgaflen

42. Terminering • E. coli kromosomet er sirkulært så de to replikasjonsgaflene møtes i et termineringsområde, Ter • Ter består av gjentatte 20 basers motiv • Her bindes proteinet Tus (terminus utilization substance) • Når den første replikasjons-gaffel treffer Ter-Tus-komplekset stopper den. Den andre stopper i møtet med den første

43. Terminering • Etter fullført replikasjon henger det to nye kromosomene sammen, de er katenerte • DNA topoisomerase IV frigjør dem fra hverandre