Daniel Kahn, Hidde de Jong, Delphine Ropers,

1. Comment modéliser l'interaction entre régulations métaboliques et régulations géniques ? L'exemple du métabolisme carboné chez E. coli Daniel Kahn, Hidde de Jong, Delphine Ropers, Hans Geiselmann, Jean-Charles Portais et Jean-Luc Gouzé

2. Problématique générale de la régulation • Les régulations cellulaires comportent plusieurs niveaux • Réseaux de régulation de gènes • Régulations métaboliques • Ces niveaux interagissent • L’expression génique influe sur le métabolisme par les changements de concentration d’enzymes • Réciproquement le métabolisme influe sur l’expression des gènes • Existe-t-il une ‘logique’ de l’articulation des deux types de régulation ? • Sont-ils interchangeables ou contraints ? • Importance relative des composantes génique et métabolique

3. Analyse modulaire dite « hiérarchique » module 1 métabolisme module 2 protéines module 3 mRNA

4. La matrice de stoechiométrie • Les réactions du réseau métabolique sont exprimées dans lamatrice de stoechiométrieN, dont les colonnes contiennent les coefficients de stoechiométrie de chaque réaction • Cette matrice reflète la structure du système • L’équation d’évolution des concentrations x du système s’écrit alors simplement en fonction des vitesses v : • Formalisme à la base de la Théorie du Contrôle Métabolique (MCT) dx / dt = N · v(x,p)

5. Analyse modulaire en MCT Kahn & Westerhoff (1991) J. Theoret. Biol. 153:255-285 • Décomposer les matrices par blocs • L’absence de flux de matière entre modules rend la matrice de stœchiométrie diagonale par blocs N = • Cela permet le calcul explicite de l’effet des interactions entre niveaux sur le contrôle global • On peut ainsi calculer l’effet d’un feed-back du métabolisme sur l’expression génique

6. MCT et analyse de la régulation • Ce sont des sensibilités locales  uniquement les dynamiques locales au voisinage de l’état stationnaire • Formalisme non adapté à la description de transitions abruptes • Ne permet pas d’interpréter les transitoires entre états stationnaires éloignés

7. 1 s-(x, θ) 0 x  A B x : protein concentration . . xbbs-(xa, a1) s-(xb, b2 ) – bxb xaas-(xa, a2) s-(xb, b1 ) – axa  : threshold concentration - - - -  ,  : rate constants b a Modèle LPM de réseau génique • de Jong et al. (2003) Bioinformatics 19:336-344 • Modélisation par des fonctions en escalier: • Systèmes différentiels linéaires par morceaux (LPM)

8. QS25 QS23 QS24 QS22 QS21 QS17 QS18 maxb QS16 QS20 QS19 D24 D22 D23 D25 D21 QS12 QS14  b2 D18 D19 D17 D20 D16 QS15 QS11 QS13 D15 D14 D13 D12 D11 QS7 QS6 QS8 D10 D9 D8 D6 D7  b1 QS10 QS9 D5 D4 D3 D2 D1 0 QS5 QS4 QS2 a6 QS3 a1 QS1 maxa Graphe de changement d’états • Contient les états d’équilibre (et les cycles éventuels) • Simulation qualitative: chemins atteignables dans ce graphe à partir d’un état initial donné

9. Genetic Network Analyzer (GNA) de Jong et al. (2003) Bioinformatics 19:336-344 Environnement de simulation de dynamiques qualitatives

10. Articuler les régulations • Modéliser conjointement les régulations métaboliques et géniques: • Réduire et simplifier pour pouvoir abstraire un fonctionnement intelligible • Développer une méthodologie de modélisation compositequi combine des approximations différentes adaptées aux deux types de régulation • Mesurer les contributions respectives des deux types de régulation • Forces et faiblesses du modèle du point de vue systémique (robustesse, sensibilité, homéostasie, adaptabilité…) • Comprendre la logique biologique de la répartition entre les deux types de régulation

11. Gluconate Ribose GNTT RIBT gnt Glucose rib GNTK PTSG RIBK G6PDH PGL 6pgl g6p 6pg 6PGDH EDD PGI MPI PTSM TKTA TAL RPI Mannose m6p f6p gap r5p rb5p FBP GLPX e4p s7p x5p kdpg RPE PFK Fructose fbp EDA ga PTSF TK TKTB ALD f1p FBA x5p dhap gap TPI pyr GAPDH DEOA dr5p bpg DEOT DEOK acetaldh PGK ALDHA ALDHB ADH DeoxyRibose 2pg PGM 3pg PTA ACK PDH acp Acetate ENO acoa PPC pep ACS CS cit oaa PTSG PYK PPS PCK ACN MDH ODC glx icit n1 (ADP+Pi) n1 ATP EDA MAEa ICL MALS NADH,H+ NAD+ IDH RESP1 pyr mal akg MAEb n2 (ADP+Pi) n2 ATP FUM KGDH POX ? n2 (ADP+Pi) n2 ATP Pyruvate Acetate + CO2 FADH2 FAD POX fum succoa SDH STK RESP2 Acetate suc Système biologique Métabolisme carboné d’E. coli

12. Diauxie glucose-acétate • Transition bien caractérisée • Implique des changements importants • Au niveau métaboliqueGlycolyse vers gluconéogénèse • Au niveau génique • Interaction forte des deux niveaux Oh et al. (2002), J Biol Chem. 277(15):13175-83.

13. Modèle à base d’ODEs • Bettenbrock et al. (2005), J. Biol. Chem., 281(5): 2578-2584 • Modèle cinétique avec plusieurs dizaines d’équations et plus de 100 paramètres

14. fis P gyrAB P cya P1-P’1 P2 FIS GyrAB CYA DNA supercoiling cAMP•CRP Signal (lack of carbon source) protein TopA CRP gene tRNA rRNA topA P1-P4 promoter crp P1 P2 rrn P1 P2 Modèle de régulation génique Ropers et al. (2006), Biosystems 84:124-152

15. Modèle ‘benchmark’ • Modèle de régulation entièrement spécifié par équations différentielles ordinaires (ODEs) • Objet ‘expérimental’ pour tester différentes approches de réduction et d’approximation

16. Quelle réduction, quelles approximations ? • Décomposition du système en une composante lente (génique) et une composante rapide (métabolique)  sous-système rapide algébrique (hypothèse de quasi-stationnarité) • Agrégation de variables • Approximations des réponses fortement coopératives par des fonctions en escalier • Différentes linéarisations des réponses métaboliques • Comparaison des modèles réduits et/ou simplifiés avec le modèle complet à base d’ODEs

17. Modélisation de la diauxie glucose-acétate • Evaluation du modèle par analyse des dynamiques qualitatives (model-checking) • Identifiabilité des paramètres • Estimation de paramètres du modèle simplifié sur la base de données expérimentales : • métaboliques (concentrations, flux: RMN du 13C, IC-MS) • Expression génique (activités enzymatiques, microarrays, gènes rapporteurs)

18. Volet expérimental • Les prédictions les plus intéressantes du modèle seront vérifiées par construction de mutants appropriés : • Au niveau des variables métaboliques • Au niveau de la dynamique d’expression du système(rapporteurs fluorescents) Zaslaver et al. (2006), Nature Methods, 3(8): 623-628

19. Rôles respectifs des régulations • Etude de la réponse métabolique dans le modèle lorsque les régulations géniques sont supprimées • Evaluation de la contribution de la composante génique à la réponse métabolique «  Coefficients de régulation  »

20. ‘hierarchical’ mixed antagonistic metabolic Typologie des régulations

21. Bio-info du métabolisme dans HELIX • Annotation, prédiction de réactions et de voies métaboliques • Environnement Genostar d’exploration de génomes • Système PRIAM d’identification d’enzymes • Bases de données du métabolisme • Base UniPathway de voies métaboliques • Analyse structurale du métabolisme • Analyse de l’évolution du métabolisme • Modélisation des flux et de leur régulation

22. Axes de collaboration INRA-HELIX • Lactococcus lactis Département MICA M. Cocaign-Bousquet, INRA-INSA Toulouse P. Renault, Jouy • Buchnera aphidicola Département SPE H. Charles, INRA-INSA Lyon • Escherichia coli Département MICA JC Portais, INRA-INSA Toulouse • Modélisation des flux et de leur régulation • Delphine Ropers, Hidde de Jong, Daniel Kahn • Annotation, bases de données, analyse structurale • MF Sagot, A Morgat, • A Viari, E Coissac • Modélisation des flux et de leur régulation • Delphine Ropers, Hidde de Jong, Daniel Kahn

24. Rossell et al. (2006), PNAS 103:2166-2171 ~ metabolic regulation coefficients ‘hierarchical’

25. Préciser le rôle des régulations géniques • On observe un panachage des différents types de régulation • Le flux à travers une même étape peut être régulé de manière différente, selon l’état physiologique de la cellule • Ce coefficient de régulation ‘génique’  ne prend pas en compte les changements d’expression des autres enzymes du système • Donc le coefficient de régulation ‘métabolique’ dérive aussi indirectement de ces changements d’expression • Les contributions génique et métabolique de la régulation ne sont donc pas entièrement séparées  utilité du modèle conjoint

26. La matrice de stoechiométrie Les réactions du réseau métabolique sont exprimées dans lamatrice de stoechiométrieN, dont les colonnes contiennent les coefficients de stoechiométrie de chaque réaction.   La matrice de stoechiométrie reflète la STRUCTURE du SYSTEME L’évolution du système s’écrit : dx / dt = N · v(x,p)

27. L’évolution du système s’écrit : dx / dt = N · v(x,p) En termes de molarités indépendantes : dx = L · dx0 avecN = L · N0 dx0 / dt = N0 · v

28. La matrice d’ élasticité D = dv / dx Les coefficients d’élasticité reflètent la SENSIBILITE des REACTIONS dv = D · L · dx0 et le système différentiel est caractérisé par le JacobienÁ: Á = N0 · D · L

29. Relations de sommation Ces relations classiques s’écrivent pour des coefficients de contrôle normalisés : Flux : Molarités :

30. Relations de sommation par blocs La somme des coefficients de contrôle est effectuée sur toutes les réactions d’un modulem: pour j  m pour j  m  j Le contrôle global d’un module sur un autre est identiquement nul. L’analyse de la régulation nécessite de séparer les termes, par exemple les activités de synthèse, de modification et de dégradation.

31. Qualitative modeling and simulation • Computer support indispensable for dynamical analysis of genetic regulatory networks: modeling and simulation • precise and unambiguous description of network • systematic derivation of behavior predictions • Method for qualitative simulation of large and complex genetic regulatory networks • Method exploits related work in a variety of domains: • mathematical and theoretical biology • qualitative reasoning about physical systems • control theory and hybrid systems de Jong, Gouzé et al. (2004), Bull. Math. Biol., 66(2):301-340

32. maxb . . xb  b2 . .  b1 0 maxa a1 a2 xa Domains in phase space • Phase space divided into domains by threshold planes • Different types of domains: regulatory and switching domains Switching domains located on threshold plane(s)

33. model in D3 : . . xaa– axa xaa– axa . . xbb – bxb xb – bxb model in D1 : (D1) (D1)  {(a /a, b /b)} (D3)  {(a /a, 0)} D3 (D3) D1 . . xaas-(xa, a2) s-(xb, b1 ) – axa xbbs-(xa, a1) s-(xb, b2 ) – bxb Analysis in regulatory domains • In every regulatory domain D, system monotonically tends towards target equilibrium set (D) maxb xb  b2  b1 0 maxa a1 a2 xa

34. xb xb (D1) D3 D4 D5 D2 D1 D3 (D5) 0 (D3) (D4) 0 (D3) xa xa • Filippov generalization of PL differential equations • Gouzé, Sari (2002), Dyn. Syst., 17(4):299-316 Analysis in switching domains • In every switching domain D, system either instantaneously traverses D, or tends towards target equilibrium set (D) Dand (D) located in same threshold hyperplane

35. (D1) maxb  b2 D3 D2  b1 D1 QS3 QS1 QS2 0 a2 a1 maxa Qualitative state and state transition • Qualitative state is discrete abstraction, consisting of domain D and relative position of target equilibrium set(D) QS1   D1,{(1,1)} • Transitionbetween qualitative states associated with D and D', if trajectory starting in D reaches D'

36. QS25 QS23 QS24 QS22 QS21 QS17 QS18 maxb QS16 QS20 QS19 D24 D22 D23 D25 D21 QS12 QS14  b2 D18 D19 D17 D20 D16 QS15 QS11 QS13 D15 D14 D13 D12 D11 QS7 QS6 QS8 D10 D9 D8 D6 D7  b1 QS10 QS9 D5 D4 D3 D2 D1 0 QS5 QS4 QS2 a2 QS3 a1 QS1 maxa State transition graph • Closure of qualitative states and transitions between qualitative states results in state transition graph Transition graph contains qualitative equilibrium states and/or cycles

37. (D1) maxb maxb  b2  b2 (D1)  b1  b1 D1 0 0 a2 a2 a1 a1 maxa maxa D6 D7 D6 D7 D2 D2 D1 QS7 QS6 QS6 QS1 QS2 QS1 Robustness of state transition graph • State transition graph, and hence qualitative dynamics, is dependent on parameter values

38. Ordering of threshold concentrations of proteins 0 < a1<a2<maxa 0 < b1<b2<maxb • Ordering of target equilibrium values w.r.t. threshold concentrations a2<ka / ga<maxa b2<kb / gb<maxb maxb maxb kb /gb  b2  b2  b1  b1 xb xb maxa 0 0 maxa a1 a1 a2 a2 a /ga xa xa Inequality constraints • Same state transition graph obtained for two types of inequality constraints onparameters , ,and :

39. maxb maxb xb  b2 b2 b1  b1 QS 4 QS1 QS2 QS3 maxa xa 0 a6 a1 maxa a2 D1 a1 QS1 QS 4 QS1 QS2 QS3 QS2 QS3 QS 4 Qualitative simulation • PL model supplemented with inequality constraints results in qualitative PL model • Given qualitative PL model, qualitative simulation determines all qualitative states that are reachable from initial state through successive transitions

40. Genetic Network Analyzer (GNA) • Qualitative simulation method implemented in Java 1.4: Genetic Network Analyzer (GNA) Graphical interface to control simulation and analyze results de Jong et al. (2003), Bioinformatics, 19(3):336-344

41. Nutritional stress response in E. coli • Response of E. coli to nutritional stress conditions controlled by network of global regulators of transcription Fis, Crp, H-NS, Lrp, RpoS,… • Network only partially known and no global view of its functioning available • Computational and experimental study directed at understanding of: • How network controls gene expression to adapt cell to stress conditions • How network evolves over time to adapt to environment • Projects: inter-EPST, ARC INRIA, and ACI IMPBio ENS, Paris ; INRIA ; UJF, Grenoble ; UHA, Mulhouse

42. CRP Fis P fis crp P1 P2 Activation Supercoiling Cya cya P1/P1’ P3 TopA GyrAB Stress signal gyrAB P P1 Px1 topA RssB GyrI rssB P gyrI P σS Stable RNAs P ClpXP P1 nlpD1 nlpD2 rpoS rrn P1 P2 Draft of stress response network Laget et al. (2004)

43. Validation of network models • Bottleneck of qualitative simulation: visual inspection of large state transition graphs • Goal: develop a method that can test if state transition graph satisfies certain properties Is transition graph consistent with observed behavior? • Model checking is automated technique for verifying that finite state system satisfies certain properties • Computer tools are available to perform automated, efficient and reliable model checking (NuSMV) • Clarke et al. (1999), Model Checking, MIT Press

44. . . xa<0 xb=0 . . There Exists a Future state wherexa>0andxb>0and starting from that state, thereExists a Future state wherexa=0andxb<0 . . QS8 . xa<0 xb>0 . QS7 . . xa=0 xb=0 . . . . . . QS6 . xa=0 xb<0 . xa>0 xb<0 . EF(xa>0 Λ xb>0 Λ EF(xa=0 Λ xb<0)) Yes! xa>0 xb>0 . QS5 QS2 QS1 QS3 QS4 Model checking • Use of model-checking techniques • transition graph transformed into Kripke structure • properties expressed in temporal logic

45. - Signal - Kripke structure temporal logic . . EF(xhpr>0 ΛEF EG(xhpr=0)) model checking Summary of approach • Test validity of B. subtilis sporulation models “ [The expression of the gene hpr] increase in proportion of the growth curve, reached a maximum level at the early stationary phase [(T1)] and remained at the same level during the stationary phase” (Perego and Hoch, 1988) • Batt et al. (2004), SPIN-04, LNCS

46. Conclusions • Implemented method for qualitative simulation of large and complex genetic regulatory networks Method based on work in mathematical biology and qualitative reasoning • Method validated by analysis of regulatory network underlying initiation of sporulation in B. subtilis Simulation results consistent with observations • Method currently applied to analysis of regulatory network controlling stress adaptation in E. coli Simulation yields predictions that can be tested in the laboratory

47. Work in progress • Validation of models of regulatory networks using gene expression data Model-checking techniques • Search of attractors in phase space and determination of their stability • Further development of computer tool GNA Connection with biological knowledge bases, … • Study of bacterial regulatory networks Sporulation in B. subtilis, phage Mu infection of E. coli, signal transduction in Synechocystis, stress adaptation in E. coli

48. References de Jong, H. (2002), Modeling and simulation of genetic regulatory systems: A literature review, J. Comp. Biol., 9(1):69-105. de Jong, H., J. Geiselmann & D. Thieffry (2003), Qualitative modelling and simulation of developmental regulatory networks, On Growth, Form, and Computers, Academic Press,109-134. Gouzé, J.-L. & T. Sari (2002), A class of piecewise-linear differential equations arising in biological models, Dyn. Syst., 17(4):299-316. de Jong, H., J.-L. Gouzé, C. Hernandez, M. Page, T. Sari & J. Geiselmann (2004), Qualitative simulation of genetic regulatory networks using piecewise-linear models, Bull. Math. Biol., 66(2):301-340. de Jong, H., J. Geiselmann, C. Hernandez & M. Page (2003), Genetic Network Analyzer: Qualitative simulation of genetic regulatory networks, Bioinformatics,19(3):336-344. de Jong, H., J. Geiselmann, G. Batt, C. Hernandez & M. Page (2004), Qualitative simulation of the initiation of sporulation in B. subtilis, Bull. Math. Biol., 66(2):261-340. GNA web site:http://www-helix.inrialpes.fr/article122.html