Bactériologie et Médecine d’Urgence

1. Bactériologie et Médecine d’Urgence Chantal Roure Sylvestre Tigaud Laboratoire de Bactériologie Hôpital de la Croix-Rousse

2. Un Facteur Limitant : Le Temps Patient Examen Clinique Hypothèse Diagnostique AntibiothérapieProbabiliste Prélèvements 48 heures Evolution Clinique Antibiogramme

3. Objectifs des analyses microbiologiques • Isoler, identifier les micro-organismes pathogènes et étudier leur sensibilité aux ATB • Assurer la viabilité des bactéries potentiellement pathogènes dans les échantillons • Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA) • Maitrise des phases pré-analytiques, analytiques et de validation

4. Phase pré-analytique • Prescription médicaleTraçabilité : Fiche de liaison • Identité patient, prescripteur,préleveur • Renseignements utiles à la qualité de l’analyse • Execution du prélèvement • Le site du prélèvement • Méthodes de prélèvement • Modalités de transport et de conservation • Sécurité

5. les deux types d’examens • Diagnostic direct : mise en évidence du germe. • Microscopie • Culture • Immuno-diagnostic • Amplification génique. • Sérodiagnostic (élévation des anticorps)

6. Diagnostic indirect • Pour toutes les sérologies • Préciser ce que l’on cherche, et pourquoi, • Prélever sur un tube sec, • Prévoir un deuxième tube à 10-15 jours d’intervalle à envoyer au même laboratoire • Intérêt : • Brucellose en phase subaigüe ou chronique • Rickettsiose, Coxiellose, Legionellose, Leptospirose, Lyme

7. Examen Cytologique • Riche d'information si et seulement si : • Prélèvement normalement stérile (LCR) • Morphologie des germes caractéristique (Pus à Staphylocoque, Gonocoque, Méningocoque) • Modification caractéristique d'une flore conplexe (Gardnerellose, Cholera) • Impossible sur les Hémocultures (facteur de dilution) L'examen microscopique n'intervient qu'après un temps de culture.

8. Dénombrement microbien • Standardisé, simplifié et reproductible lorsque les germes sont en phase liquide homogène : cas des prélèvements urinaires. • Dans les autres cas: dénombrement peu informatif fonction procédure d'homogénéisation et qualité du prélèvement...

9. Cultures bactériennes • Il est illusoire d'imaginer que le bactériologiste va cultiver tous les germes possibles et imaginables • L'ensemble des procédures ont été sélectionnées pour diagnostiquer les germes pathogènes les plus probables. • Ne jouez pas à cache-cache avec votre bactériologiste ! Si vous avez des arguments d'orientation, dites-les !

10. Identification-Antibiogramme • L'identification repose sur un ensemble d'arguments: Au fur et à mesure que le temps passe, nous précisons l'identification. • L'antibiogramme est devenu un ensemble technique et conceptuel global, permettant de porter un diagnostic sur le phénotype de sensibilité. C'est le concept d'INTERPRETATION de l'antibiogramme, qui impose le choix d'antibiotiques testés DISCRIMINANTS

11. Hémocultures (1) • Prélèvement princeps de la Bactériologie. • Quand prélever ? • Avant Antibiothérapie, • ou au cours d'une fenêtre, • ou le plus loin possible de l'injection • ou n'importe quand... Efficacité

12. Hémocultures (2)Réaliser un prélèvement de qualité • Eviter les contaminants: • antisepsie de la peau et désinfection du capuchon du flacon d’hémoculture • Prélever une quantité de sang suffisante: • densité bactérienne souvent faible <1 UFC/ml • un volume de 20 ml de sang prélevé augmente le pourcentage de positivité de 30% comparativement à un volume de 10 ml • Effectuer le nombre de prélèvement nécéssaire: • bactérièmie souvent transitoire ou intermittente • 30 à 60 min entre 2 prélèvements : 6 flacons/24H

13. Hémocultures (3)Choisir des conditions de culture appropriées • Aérobiose-anaérobiose • Dilution du sang: • dilution optimale 1/10, chez l’enfant un prélèvement de 1 à 2 ml est satisfaisant, les flacons pédiatriques ont peu d’intérêt • Anticoagulant SPS: • inhibe l’activité bactéricide du sérum, la phagocytose, inactive le complément et neutralise les aminosides • Neutralisation des antibiotiques: • résines adsorbeuses de cations ou charbon activé • indication: contrôle de l ’EI fébrile sous traitement

14. Hémocultures (4)Détecter précocément la croissance bactérienne • Durée d’incubation suffisante : 7 jours à 35°C • Méthodes automatisées +++ • Méthodes manuelles • Examen macroscopique quotidien des flacons • Centifugation-lyse: système Isalator: lyse cellulaire et concentration des micro-organismes puis encemencement sur milieux adaptés • Intéret : • Mycobactéries, levures et champignons filamenteux • Bactéries exigentes: HACEK, Bartonella, Legionella • Prélèvements médullaire des brucelloses

15. Hémocultures (5) • Il faut signaler : • Les germes dangereux : Brucellose, Typhoïde, Francisellose • Les germes à croissance difficile : Brucellose, Actinomycose • Les germes quiescents : Endocardite Infectieuse, HACEK • Les Levures • Les prises d'antibiotiques • Il faut utiliser des dispositifs spéciaux : • Pour les Mycobactéries • Pour les Chlamydia, Rickettsies, Bartonella

16. Prélèvements Pulmonaires • Préciser les recherches spécifiques • Mycobactéries, Legionelles,Aspergillus) • Acheminer sans délai pour éviter la prolifération de la flore commensale • Crachat : • Intéret dans les Pneumopathies communautaires à condition que la contamination salivaire soit minimale • Intéret de l'examen direct • LBA et Brossage : plus informatifs

17. Urines (1) • Examen cyto-bactériologique • Recherche d’antigène spécifique : délai 30 min • Legionella pneumophila 1 • Streptococcus pneumoniae

18. Urines (2)Schéma de réalisation Ensemencement: anse calibrée J0 Cytologie Leucocyturie Germes Dénombrement Observation des cultures J1 Identification Antibiogramme J2

19. Urines (3) • Recueil des urines et acheminement • cas général habituel: « milieu du jet » après toilette • cas particulier: • recherche de mycobactéries sur la totalité de la 1ère miction du matin après restriction hydrique, 3 jours de suite • suspicion d’infection urétérale ou prostatique: recherche de Chlamydia trachomatis ou de Mycoplasma sur urines du 1er jet • Contenant • poudrier stérile • système de transport type Monovette

20. Urines (4)Interprétation • Depuis les travaux de KASS: • bactériurie <10*3 UFC/ml: absence d’infection • bactériurie > 10*5 UFC/ml: infection probable • entre 10*3 et 10*4 UFC/ml: zone d’incertitude • Ces critères doivent être interprétés en fonction • des données de l ’examen direct • du caractère mon ou pluri-microbien des cultures • des renseignements cliniques • Place des bandelettes urinaires • bon pouvoir prédictif négatif

21. Prélèvements de Pus et Liquides purulents • Souvent très informatifs, • Le prélèvement doit permettre • une cytologie, • la survie des germes fragiles, en particulier anaérobies. • Ecouvillonage superficiel : intéret médiocre • Chaque fois que possible, utiliser des dispositifs de survie des germes non prolifératifs (par exemple, Portagerm®).

22. Plaies, écoulement purulent • Contexte • suppurations primitives: anthrax, furoncles • plaies traumatiques: • habituellement surinfectées par des bactéries pyogènes • morsures • plaies contaminées par la terre ou l ’eau • brulures • Mode de prélèvement • aspirer le pus dans une seringue puis aspirer 1 ml d ’eau physiologique stérile • A défaut utiliser des écouvillons

23. LCR • Acheminer le prélèvement sans délai • Donner une orientation étiologique rapide • examen macroscopique, cytologique et biochimique • examen après coloration de Gram : positif dans 60 à 90% des cas en absence d’antibiothérapie préalable • intérêt relatif de la recherche des Antigènes solubles (pneumocoque, méningocoque A, B, C, Haemophilus b) • Ensemencer d’urgence les milieux de culture • Interpréter les résultats des cultures • méningite communautaire/décapitée

24. Les prélèvements Génitaux (1) • Renseignements clinico-épidémiologique • Qualité du prélèvement et du transport !!! ( M.S.T. donc germes fragiles) • Suivre les recommandations du laboratoire local pour les recherches spécifiques (Mycoplasmes, Chlamydia) • Prendre contact avec le bactériologiste pour les germes exceptionnels (Hemophilus ducreyi par ex.)

25. Les prélèvements Génitaux (2) • Examen extemporané au microscope au fond noir de Treponema pallidum à partir de la sérosité d’un chancre • Recherche à l’état frais de Trichomonas vaginalis • Après coloration de Gram: • diplocoques Gram négatif évoquant un gonocoque • déséquilibre de la flore commensale, présence de « clue-cells » dans les vaginoses bactériennes • Techniques d’amplification génique en routine • Chlamydia trachomatis (Prélèvement vaginal, urétral ou d’urine), N. gonorrhoeae

26. Les Amplifications Géniques • Techniques à n’utiliser qu’en collaboration transparente avec le biologiste. • Coût prohibitif des techniques. • Sensibilité réelle souvent inférieure à la sensibilité théorique. • Il faut au minimum savoir ce que l’on cherche...

27. Prélèvement de gorge (1)Contexte • Angines à Streptococcus pyogenes • sensibilité de la culture (90-95%) contre 80-90% pour les trousses de détection rapide • Autres contextes: • angine ulcéro-nécrotique : recherche de l’association fusospirochétienne • angine à fausse membrane : isolement de C. diphteriae • candidose oro-pharyngée : recherche de C. albicans • bilan initial de MST: isolement de N. gonorrhoeae

28. Prélèvement de gorge (2)Contexte • Aucun intérêt dans : • le phlegmon de l’amygdale (collection fermée) • l’épiglottite principalement due à Haemophilus influenzae • le syndrome angine-infarctus pulmonaire de Lemierre (du à Fusobactérium necrophorum) • les ulcérations oro-pharyngées : Treponema pallidum difficile à distinguer des tréponèmes commensaux

29. Stratégie de la coproculture (1) • Contexte • plusieurs contextes épidémiologiques peuvent être identifiés en France métropolitaine • les renseignements cliniques sont essentiels. • Conservation à 4°C • Diarrhées à germes invasifs/ Diarrhées à germes entérotoxigéniques (examen direct)

30. Stratégie de la coproculture (2) • Coproculture standard • adulte, enfant de plus de 2 ans, pas de contexte particulier rechercher Salmonella, Shigella, • Campylobacter • chez l’enfant, • chez l’adulte sur demande ou si selle liquidc • Yersinia • enfants diarrhéiques • sur demande, tableau d’adénite mésentérique

31. Stratégie de la coproculture (3) • Cas particuliers (sur prescription) • Enfant avant deux ans : +/- recherche d’Escherichia coli entéropathogènes (NB: origine virale fréquente) • Voyage en pays tropical : ajouter V.cholerae • Diarrhée séro-sanglante de type toxinique: Aeromonas et Pleisiomonas: absorption d’eaux polluées ou d’aliments contaminés (zone tempérée ou tropicale) • Diarrhée post-antibiotique : ajouter C.difflcile • SHU : ajouter la recherche des Escherichia coli entéro-hémorragiques producteurs de vérotoxine • Epidémiologie (TIAC , portage de BMR)

32. Bioterrorisme • Les principaux candidats: • Bacillus anthracis • Yersinia pestis • Francisella tularensis • Brucella • Agents des fièvres hémorragiques • Monkey Pox • Toxine botulique

33. Bioterrorisme • Diagnostic microbiologique • Prélèvements de sources potentielles de contamination • prise en charge au CRSSA • Prélèvements cliniques • prise en charge par les laboratoires hospitaliers • méthodologie standardisée: hôpitaux référents • choix de la technique: culture/biologie moléculaire • interprétation • sujet contact d’une action bioterroriste: quel est le rendement d’un prélèvement ? (ex écouvillonnage nasal/ charbon)