Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular

1. Principios y Aplicaciones de Oncología Molecular Dr. Andrés Báez-Astúa, PhD. Hospital Dr. Rafael A. Calderón Guardia 02 de octubre del 2012

2. CONTENIDO • Introducción • Genética del Cáncer • Métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • Fluorescencia in situ para estudios en cáncer • Citometría de Flujo • Cultivo de tumores • Proyectos de investigación y colaboraciones

3. Unraveling cancer Unlocking cancer genes TCGA – The Cancer Genome Atlas Pilot Launched NIH launches project to map cancer genome

4. Cancer’s Reach • Men have an almost 1 in 2lifetime risk of developing cancer. In the United States: Women have a more than 1 in 3 lifetime risk of developing cancer. Source: Cancer Facts & Figures 2004, American Cancer Society

5. A Defining Moment in the Nation’s “war on cancer” — Unprecedented Potential for Exponential Progress Toward Personalized Medicine (Molecular Oncology) Imagen cortesía de Nature, Feb. 15, 2001

6. Data Generation: Unprecedented Scale ClinicalData Molecular Data Databases (Current and Developing): partial genomes; SNPs; gene expression profiles; gene sequence; chromosome changes; copy number changes; chemical genomic libraries; epigenomics; “signatures”; disease biomarkers; pathologic; imaging – various types; chemical libraries; proteins (mass spec); proteins (chips); biospecimens/biorepositories; patient records; antibodies; pathology; molecular pathology; clinical trials; adverse events; pharmacogenomics; molecular epidemology; ........... .

7. Introducción • El estudio de cambios moleculares han llevado históricamente a la identificación de oncogenes y supresores tumorales. Clarke MF. Pathol Biol, 2006 • Los tumores se desarrollan por acumulación de alteraciones moleculares y genómicas. Futreal P. Nature Reviews Cancer 2004 • El Proyecto Genoma Humano facilitó el enfoque hacia el estudio de alrededor de 30,000 genes que codifican proteínas. McKusick VA. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2005 • Un paso limitante del ritmo de descubrimientos de nuevos oncogenes y genes supresores ha sido la falta de enfoques eficaces para su identificación. Garnis C. Molecular Cancer, 2004

8. Genes de Cáncer • Afectan positivamente (Oncogenes) o negativamente (Supresores) el crecimiento celular. • Oncogénesis: el cáncer emerge a través de una serie de alteraciones • somáticas en el ADN. • Consecuencia de errores de replicación del ADN aleatorios, exposición • a cancerígenos o por procesos de reparación del ADN defectuosos. • Asociación familiar de cáncer ocurre en ciertas familias que portan una • mutación de línea germinal en un gen de cáncer.

9. Aplicación de Bases Moleculares Genómica bioinformática, secuenciación genómica, ingeniería genética, terapia genética, genómica comparada, epigenética Transcriptómica expresión genética, regulación de mARN Proteómica separación, identificación, cuantificación, análisis de secuenciación, proteómica estructural, proteómica de interacción, modificación protéica, proteómica celular Pharmacogenómica correlación de expresión genética o polimorfismos con eficacia y toxicidad de una droga

10. Objetivo General Brindar servicio de apoyo a la red oncológica a través de un centro altamente especializado en técnicas avanzadas de biología celular y molecular aplicadas a la prevención, diagnóstico, tratamiento y seguimiento de personas con riesgo o portadoras de enfermedades neoplásicas

11. Beneficios de los Estudios Moleculares en Cáncer • Incrementar la sensibilidad y reproducibilidad diagnóstica • Descubrir pocas células con cambios genéticos para estimular cambios de exposición a factores de riesgo, intervención temprana o quimio-prevención • Identificar moléculas tumorales para dirigir un tratamiento idóneo • Detección de enfermedad residual mínima o recurrente • Distinguir entre metástasis de un tumor o un segundo primario • Conocer mejor la biología de las neoplasias más importantes en nuestro medio

12. Vision: 21st Century Personalized Medicine predict Look for genetic links to disease detect Monitoring and prevention pinpoint Better targeted diagnostics (In-vitro diagnostics, imaging) treat personalize Treatment selection Treatment track Treatment monitoring (In-vitro diagnostics, imaging)

13. Personalized Medicine Is Transforming Discovery/Development/Delivery

14. Ensayos Basados en PCR • Evaluar pérdida de regulación celular por • Alteraciones en secuencias • Metilación de ADN • Infecciones virales • Genes que controlan división celular, reparación celular, apoptosis y angiogénesis

15. Ensayos PCR cuantitativa Tiempo Real (Real Time-Polimerase Chain Reaction): • Identificación presuntiva de SNP’s e inestabilidad de microsatélites en cáncer de colon. • Caracterización oncogenes relacionados con cáncer de mama hereditario: BRCA1 y BRCA2. • Alteraciones en oncogenes/genes supresores en cáncer de cérvix (p53, pRb, p16INK4a). • Carcinoma de Colon No-Polipomatoso Hereditario: MLH1, MLH2, MSH6. • Poliposis Familiar Adenomatosa: gen APC. • Expresión de factores biológicos (citocinas, factores de crecimiento, moléculas indicadoras de muerte celular alterada).

16. Metodologías para Análisis Genómico Global Perfil de Expresión Microarreglos (microarrays) de expresión genética cDNA Arrays: generados por PCR Oligonucleotide Arrays: proceso fotolitográfico o directamente oligos 25% de estudios con microarrays son en cáncer Depende de factores difíciles de controlar e.g. infiltración estromal y de células inflamatorias ARN de tejido premaligno escaso se puede amplificar en cADN Pollack JR. et al Nature Genetics, 1999.

17. Modelos de Progresión de Cáncer Cáncer de mama Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

18. Modelos de Progresión de Cáncer Cáncer de próstata Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

19. Modelos de Progresión de Cáncer Carcinoma pulmonar de células escamosas (NSCLC) Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

20. Modelos de Progresión de Cáncer Cáncer colorectal Garnis et al. Molecular Cancer, 2004. Inestabilidad microsatélite: genes de reparación Inestabilidad cromosómica: APC y b-catenina

22. Growth factors • Mutations in KRAS leads to resistance to anti-EGFR antibodies due to constantly active KRAS • KRAS mutations are complex, multiposition mutations • The most common KRAS activating mutations are found in codons 12, 13 and 61 • The KRAS status of a tumor may be indicative of prognosis and predictive of response to certain drugs • Monoclonal antibodies • Cetuximab(Erbitux) • Panitumumab (Vectibix) Y EGFR Cell membrane KRAS Cell proliferation and survival KRAS mutation status

23. Mutations of importance within codons 12, 13 and 61 of the KRAS gene • Example of analysis of position 2 in codon 12 Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG Wild type KRAS 61 12 13 Codons CAA AAA GAA CGA CCA CTA CAC CAT wt GGT GGC TGT AGC CGT CGC AGT TGC GTT GAC GCT GTC GAT PyroMark KRAS AssayQuantitive results and sequence information

24. KRAS Resultados cuantitativos einformación de secuencia Mutaciones de importancia en codones 12, 13 y 61 del gen KRAS • Ejemplo de análisis de posición 2 en codon 12 61 12 13 Codones CAA AAA GAA CGA CCA CTA CAC CAT wt GGT GGC TGT AGC CGT CGC AGT TGC GTT GAC GCT GTC GAT Sequence to analyze: GGT GGC GTA GG KRAS silvestre KRAS Mutante codon 12 Codon 12 mutación: GGT > GAT

25. Fluorescence In SituHybridization (FISH) PCR distrajo la conciencia de otras tecnologías prometedoras como la hibridación in situ 1990’s Técnicas de fluorescencia revolucionan microscopía de luz Revela info. acerca de cambios cromosómicos e.g. pérdida o ganancia de material genético Debe ser interpretada en el contexto del ambiente celular y morfológico combinando la info. morfo-histológica y molecular para lograr un Dx Herramienta esencial para el Dx y manejo de variedad de tumores sólidos y malignidades hematológicas

26. Fluorescence In SituHybridization (FISH) Visualización microscópica los DNA cromosómicos (hasta 1-2 Kb) Sonda marcada con un compuesto fluorescente que emite señal Cada señal corresponde al número presente de genes

27. Fluorescence In SituHybridization (FISH) VENTAJAS: Técnica directa es relativamente rápida y sensible Dirigido a molécula relativamente estable No requiere cultivo celular Resultado más fácil de interpretar que cariotipos complejos Puede combinarse con inmunotinciones DESVENTAJAS: Requiere cámara y sistema captura de imágines Número limitado de sondas comercialmente disponibles Sólo casos moderadamente o altamente cargados de células anormales Proporciona información sobre sondas analizadas, no detecta otras aberraciones Pheno Path Labs, 2005

29. Fluorescence In SituHybridization (FISH) Estado de Amplificación HER-2 Ca de Mama No amplificado Señal naranja: HER2 Señal verde: CEP17 7x 4x

30. Fluorescence In SituHybridization (FISH) Estado de Amplificación gen HER-2 Ca de Mama 54% 38% Mass R, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001 19% 0% Vogel C, et al. Proc Am Soc Clin Oncol.2001

31. POBLACIÓN FISH-POSITIVA de pacientes FISH positivos serían negativos por IHC (0/1+) Falsos negativos privan a un paciente de una terapia potencialmente beneficiosa Fluorescence In SituHybridization (FISH) EN RESUMEN: FISH en selección de terapia para Ca de mama POBLACIÓN IHC-POSITIVA de pacientes IHC-positivos (2/3+) serían negativos por FISH Falsos positivos conducen a tratamientos médicos costosos de poca efectividad

32. Fluorescence In SituHybridization (FISH) Monitoreo Recurrencia Cáncer de Vejiga Pérdida de p16 es una de las alteraciones más importantes en Ca urotelial (9p21) Aneuploidía cromosomas 3, 7 y 17

33. Microscopía de Fluorescencia • Fluorescencia de Hibridización in situ (FISH) • Cáncer de mama: HER-2, TOP2A. • Cáncer de próstata: c-myc. • Cáncer de pulmón: LSI EGFR, LSI c-myc, CEP 6. • Adenocarcinoma de colon: Urokinase, c-myc. • Aplicación general en tumores: p53, p16.

34. Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) 1960’s Kametsky y colaboradores desarrollan concepto Stanford. Citometría de Flujo es una técnica usada en sangre, muestras linfoides y tisulares. Asociación de poblaciones celulares (“sorting”) Tamaño celular (FSC) Granularidad celular (SSC) Emisión de fluorescencia Medición de ploidía o análisis de ADN

35. Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) 585 nm 650 nm 530 nm

36. Side Scatter Forward Scatter Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) Delimitación de poblaciones (Gating)

37. Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

38. Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS)

39. 0 200 400 600 800 1000 4N 2N Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) DNA Analysis PI Fluorescence

40. DNA index 1.21 Aneuploid peak 0 200 400 600 800 1000 Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) DNA Analysis PI Fluorescence

41. Citometría de Flujo Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) • Aplicaciones rutinarias de citometría. • Conteo absoluto de células • Análisis de ADN y ARN • Análisis de expresión de genes indicadores • Cuantificación antigénica • Detección de apoptosis • Discriminación de células no-viables • Inmunofenotipeo • Estudios funcionales de linfocitos • Medición de proteínas intracelulares • Medición de calcio intracelular

42. Cultivo de Tejidos • Estudios para determinar resistencia a agentes citotóxicos. • Cultivo de tumores sólidos para estudio de marcadores de sobrevida celular/apoptosis. • Aislamiento de linfocitos y monocitos para ensayos de citotoxicidad in vitro contra antígenos tumorales (evidenciar presencia de respuesta inmune). • Preparación de células y cDNA para banco de tumores. • Manejo estéril general de biopsias.

44. Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.

45. Garnis et al. Molecular Cancer, 2004.