Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer

1. Clonagem e expressão do cDNA de uma isoforma da toxina Tx2-5 da aranha Phoneutria nigriventer Daniel C. Carvalho(IC), Marco A. Romano-Silva, Marco A. M.Prado, Marcus V. Gomez, Vania F. Prado e Evanguedes Kalapothakis Orientador: Prof. Dr. Evanguedes Kalapothakis Depto de Farmacologia - ICB - UFMG

2. Aranha armadeira Phoneutria nigriventer

3. Efeitos decorrentes da inoculação subcutânea do veneno de P. nigriventer: • Dor forte; • Cãibras dolorosas; • Tremores; • Sudorese; • Hipersecreção salivar; • Priaprismo; • Convulsões tônica; • Morte. • Efeitos semelhantes observados em seres • humanos decorrente da picada da aranha.

4. Canal de sódio onde estão indicados sítos de ligação para Toxinas

5. (Rezende et al., 1991) • Veneno • PhTx1 PhTx2 PhTx3 • Tx1Tx2-1 Tx2-2 Tx2-3 Tx3-1 Tx3-2 Tx3-3 • Tx2-4 Tx2-5 Tx2-6 Tx3-4 Tx3-5 Tx3-5 • Tx2-7 Tx2-8 Tx2-9 Ø Ø Ù Ù Ù Ù (Diniz et al., 1990) (Cordeiro et al., 1992) (Cordeiro et al., 1992)

6. Sequência de aminoácidos das toxinas da aranha Phoneutria nigriventer: Tx1 AELTSCFPVGHE-CDGDASNCNCCGDDVY----CGCGWGRWN----CKCKVADQSYAYGICKDKVNC Tx2-1 ATCAGQDKP-CKET---CDCCGERGE----CVCALSYEGKYR-CICRQGNFLIAWHKLASCK Tx2-5 ATCAGQDQT-CKVT---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGNFLIAAYKLASCKCK Tx2-6 ATCAGQDQP-CKET---CDCCGERGE----CVCGGP-------CICRQGYFWIAWYKLANCKK Tx2-9 SFCIP-FKP-CKSDEN---CCKKFK-----CK-TTGIVK-----LCRW Tx3-1 AECAA-VYERCGKGYKR--CC-EERP----CKCNIVMDN----CTCKKFISE Tx3-2 ACAG-LYKKCGKGASP--CC-EDRP----CKCDLAMGN----CICK Tx3-3 GCAN-AYKSC-NGPHT--CCWGYNGYKKACICSG?NWK Tx3-4 SCIN-VGDFC-DGKKD--CCQCDRDNAF-CSCSVIFGYKTN-CRCE Tx3-5 GCIG-RNESCKFDRHG--CCWPW-----CCSCCKCGQPESDVG Tx3-6 ACIP-RGEICTDD---CECCGCDNQ----CYCPPGSSLGIFKCSCAHANKYFCNRKKECKKA

7. Objetivo • Identificar e clonar neurotoxinas da glândula • de veneno da aranha Phoneutria nigriventer • relacionadas a fração PHTx2. • Subclonar as toxinas em vetores de expressão • procariotos e eucariotos (pMAL). • Estudar o efeito de cada toxina recombinate.

8. Sonda Radiotiva t t c g c t c gc g t t c g c t c a c g aggagagaactaatt ttgggaa Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat DNA polimerase

9. Dot Blot - Biblioteca de cDNA Hibridização Pré-hibrização Pré-hibrização Hibridização Sonda radioativa Pn2-5A cDNA

10. Dot Blot controle Controle Positivo Controle positivo

11. Dot Blot da Biblioteca de cDNA sonda Pn2-5A

12. Pn2-5A/Pn2-5B B11-1 bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcaga Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat B11-1 ATG AAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B11-1 GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ... B11-1 GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A B11-1 GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... B11-1 AAG AAAtga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaa Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a..........................

13. 10 20 30 40 50 60 * * * * * * * * * * * * * AM 848 ATG AAA GTC GCA ATC CTC ATC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA ACC ATT GAA GAA TAC CGT GAC GAT TTT GTT GTA GAA GAA TTG B11-1 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... .C. ... ... ... C.. B11-128 ... ... ..T ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... .C. ... ..T ... ... N.. ... ... ... C.. AM 871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... ... ... B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ..N T.. ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... N.. ... B9-80 ... ... ... S.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C ... ... ... ... B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... T.N T.. ... ... 70 80 90 100 110 120 130 * * * * * * * * * * * * * AM 848 GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AGA GGA GAA TGT GTT TGC GGA GGA CCT TGC ATT B11-1 ... ... ... ... ... XB. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B11-128 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... AM871 ..N ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... .N. ... .N. A.A .N. ... N.. ... ... ... ... ... ... ... ... B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... ... N.N .N. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B9-80 ... ... ... ... ... STN ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... N.. ... ... ... ... ... 140 150 160 170 180 190 * * * * * * * * * * * * * AM848 TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AAC TGT AAA AAATGA TAT GGA TTT ATG TAT B11-1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. .G. ..G ...... ... ... ... ... ... B11-128... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ....N. ... ... ... ... ... B9-171 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G .H.... ... ... ... ... ... B3-197 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ...... ... ... ... ... ... B9-09 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..N ...... ... ... ... ... ... B9-80 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ...... .CC ACG ATA TAA TAA B9-34 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..G ...... ... ... ... ... N.. 200 210 220 230 * * * * * * * * AM848 ACC ACG ATA TAA TAA ATA TTA TTG CAT TTG AAA AAA AAA AAA AAA B11-1 ... T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... B11-128 T.. ... ... ... ... ... ..G N.. ... ... AM871 ... ... ... ... ... ... ... ... .N. ... ..G GGG GGG GGG GGG B9-171 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B3-197 T.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... B9-09 T.. N.. ... ... ... ... ..G ... .N. ... ... .GN NGG ... ... B9-80 ATA TTG TTG C.T .TG .A. AA. AAA A.A AAA ... ... ... ... B9-34 T.. ... ... ... ..N .N. N.G

14. PEPTÍDEO SINAL PRÓ-PEPTÍDEO TOXINA MADURA Tx2-5 ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAAYKLASCKCK* Pn2-5A MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELGR ATCAGQDQTCKVTCDCCGERGECVCGGPCICRQGNFLIAWYKLASCKK* B9-80 MKVXILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* B9-171 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKX* B11-1 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFAVEELER ATCXGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM847 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFAV*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM895 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFVX*ELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVXGGPCICRQGYFWIAWYKLASCKK* AM896 MKVAILFLSILVLAVA SESIEESRDDFXVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM871 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLXR ATCAGQDQPCKXTCDXCXKXGXCVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKKX AM848 MKVAILILSXLVLAVA SETIEEYRDDFVVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLANCKK* AM872 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRDDFAVEXLER ATCAGQDQPCKXTCDCCGXXGECVCGGPCICRQGYFWIAWYKLAXCXK* AM1062 MKVAILILSILVLAVA SETIEEYRGXFAVEELER ATCAGQDQPCKETCDCCGERGECVCGGPCICRQGYFWI Pn4A MKVAIVFLSLLVLAFA SESIEENREEFPVEESAR CADINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSDSCKCRESNFKIGMAIRKKFC AM1072 MKVAIVFLSLXVLAFA SESIEENREEFPXF*SAR CXDINGACKSDCD---CCGDSVTCDCYWSXSCKCXESNFKIGMAIXKKFX* AM1054 MKVAIVFLSLLVLAFX XESIEENREEFPVEESAR CGDINAACKEEAAIV

15. PERSPECTIVAS Clonagem e sequenciamento de novas toxinas Expressão das toxinas recombinantes; Ensaios farmacológicos e eletrofisiológicos com as toxinas recombinanates.

16. PCR de colônia bactériana com pMALc2 + B11-1

17. Divisão Biologia Celular Profs.: Dr. Evanguedes Kalapothakis Dr. Luiz A. C. DeMarco Dr. Marcus V. Gomez Dr. Marco A. M. Prado Dr. Marco A. Romano-Silva Neurobiologia Molecular Profa.: Dra. Vania F. Prado

18. PCR de colônia bactériana pMAL+ pMALp2 Primers Pn2-5F e Pn2-5R

19. Pn2-5A/Pn2-5B Pn2-5B bcacgagtgtggacatatctcgatacaactcaga Pn2-5A aggagagaactaattctctctctctcctcgtgccgaattcggaagtgcaat Pn2-5B ATGAAA GTT GCA ATC CTC TTC CTC TCT ATT TTG GTG CTT GCT GTT GCA AGT GAA TCC ATT Pn2-5A ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... Pn2-5B GAA GAA TCC CGT GAT GAT TTT GCT GTA GAA GAA CTG GAG AGA GCC ACA TGC GCT GGC CAA Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ..T ... ... ... ..T ... Pn2-5B GAC CAG CCC TGC AAA GAA ACT TGC GAC TGC TGT GGA GAG AAA GGA GAA TGT GTT TGC GGA Pn2-5A ... ... A.. ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T ..A Pn2-5B GGA CCT TGC ATT TGC AGG CAA GGC TAC TTT TGG ATA GCA TGG TAT AAA CTT GCT AGC TGT Pn2-5A ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... Pn2-5bAAG AAAtga-atggatttatgtattccacgatataataaatattgttgcatttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Pn2-5a ... ... ... t..............a...g...............a.......................... Sequência de nucleotídeos do cDNA das isoformas Pn2-5a e Pn2-5b. As regiões não trasncritas estão em azul, a toxina esta destacada em verde e ainda o codon de iniciação, terminação e a região de poliadenilação em vermelho.