Pharmacologie Moléculaire 2

1. Pharmacologie Moléculaire 2 Magali Waelbroeck mawaelbr@ulb.ac.be E1.6.207

2. But du cours: • Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi l’expérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer. 43 SLIDES

3. Moyens: • Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique. • Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions… 43 SLIDES

4. Outils utilisés dans ce cours: • Programmes: • Graph Pad: utilisation et interprétation des données expérimentales ou simulées. Commentaires: voir http://www.graphpad.com/index.cfm?cmd=library.index • Spdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le “tutorial” de Gale Rhodes http://www.usm.maine.edu/~rhodes/SPVTut/index.html • Excell: simulation de résultats attendus 43 SLIDES

5. Voici quatre représentations d’une même protéine. Sur lesquelles peut on voir: • Le tracé de la chaine polypeptidique? • Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure? • Le volume occupé réellement par la protéine? • Les chaines latérales des acides aminés? • Le type d’acide aminé (Basique, acide, hdrophobe, polaire)? • La structure primaire? Secondaire? Tertiaire? Quaternaire? • La position du ou des ligands? 43 SLIDES

6. A B D C 43 SLIDES

7. Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques? • Définition du terme “affinité” • Qu’est-ce qui permet ou explique une liaison de forte affinité? • Définition du terme “spécificité” • Pourquoi dit-on qu’un enzyme, un récepteur, un ligand est très spécifique de… • Définition du terme “cinétique” • Qu’est-ce qui explique une liaison rapide ou lente? Une dissociation rapide ou lente? 43 SLIDES

8. Thermodynamique: Energie Libre R.D R+D Chemin réactionnel 43 SLIDES

9. Thermodynamique: Energie Libre R.D R+D Chemin réactionnel 43 SLIDES

10. Collisions: Phase aqueuse, T° pièce : Collisions: 1010 M-1sec-1 ≈1011M-1min-1 Protéines: peu de collisions productives: • kon typiques: • petites molécules: • 106-108 M-1min-1 • protéine-protéine: • 105 M-1min-1 43 SLIDES

11. Relations vitesse - affinité? Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteur • Vitesse association constante, • Dissociation lente  haute affinité; dissociation rapide  basse affinité • KD proportionnelle à koff 43 SLIDES

12. Trop petits: pas visibles. Échelle log? Vérification: mesure du kon de différents couples ligand - récepteurs 43 SLIDES

13. kon : comparaison de différents ligands, différents récepteurs 3 logs: 1000 x Conclusion: kon très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi? 43 SLIDES

14. Premier indice: comparaison de la vitesse d’association d’énantiomères 43 SLIDES

15. 43 SLIDES

16. Données à expliquer: • kon dépend (un peu) du ligand, • kon dépend (beaucoup) du récepteur, • kon presque identique si énantiomères, • koff détermine l’affinité relative des énantiomères… 43 SLIDES

17. Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium Steven K. Drake andJoseph J. Falke* Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado 80309-0215 Biochemistry, 35 (6), 1753 -1760, 1996. Abstract: In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca2+ binding and dissociation. 43 SLIDES

18. Galactose Binding Protein: Ca2+ Galactose 43 SLIDES

19. Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F ») « index » Ca+2 « pouce » Asp Lys (groupe C=O chaine polypeptidique) Asp Asn Ca+2 Asn « paume » 43 SLIDES

20. To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain. 43 SLIDES

21. « Gate » « Gate » Gln « gate keeper » Gln « gate keeper » Galactose binding protein: Calcium binding site Calcium binding E-F Hand (gate closed) Calcium binding E-F Hand (gate open) 43 SLIDES

22. Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb3+, used as a probe metal ion. 43 SLIDES

23. Fluorescence? Lumière = Énergie: 1 Einstein = 1 mol de photons 1 kcal = 4,1868 kJ 43 SLIDES

24. Rappel: orbitales liantes et antiliantes “liantes” “antiliantes” ( ou  ) 1* 1p * 1p Energie 1 2* 2s * 2s 2 43 SLIDES

25. Fluorescence, phosphorescence • Fluorescence: réémission de lumière immédiate; • Phosphorescence: isomérisation du spin des e-: réémission lente. 43 SLIDES

26. Excitation - - - - Emission ________ Donneur Accepteur λ (nm) FRET L’énergie dégagée par ledonneurest absorbée directement par l’accepteur,puis réémise sous forme dephotons de plus longue λ 43 SLIDES

27. Terbium (donneur) phosphorescent 3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à 10-20 Å du Tb3+ 43 SLIDES

28. 43 SLIDES

29. Q E Q Energie Libre S,T association dissociation D N,G,A Q Liaison D E Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ Chemin réactionnel Chemin réactionnel 43 SLIDES

30. Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les expressions suivantes? • Le ligand reconnaît le récepteur. • L’agoniste reconnaît le récepteur, qui s’active (laisse passer les ions Na+, Ca2+, ou Cl- ) • Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent l’ouverture du canal Cl- • L’agoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. • Pourrait-il favoriser la formation d’un complexe de basse affinité? • Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. 43 SLIDES

31. Rappel: Liaison à un site: L’association du radioligand: Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation: A l’équilibre, les deux réactions se compensent exactement : 43 SLIDES

32. -koff Cinétique de dissociation: • Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée: Sur une échelle log: Sur une échelle linéaire: 43 SLIDES

33. Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément: Cinétique d’association (1): La réaction d’association: 43 SLIDES

34. Cinétique d’association : (2) • Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant: • R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: kobs=konF+koff 43 SLIDES

35. Cinétique d’association : (3) • Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente? 43 SLIDES

36. Cinétique d’association : (4)linéarisation 43 SLIDES

37. kon koff Cinétique d’association : (5)évaluation de kon, koff • La “constante de vitesse d’association” apparente, kobs, augmente proportionnellement à F 43 SLIDES

38. Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le récepteur? 43 SLIDES

39. Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapide 43 SLIDES

40. Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et compétiteur très rapide 43 SLIDES

41. Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lent 43 SLIDES

42. Cinétique de liaison: traceur racémique 43 SLIDES

43. Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité.Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. Il suffit que k-2 soit <<k-1… 43 SLIDES