“ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE PROTEÍNAS DURANTE EL DESARROLLO CITOPLASMÁTICO DEL OVOCITO”

1. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile. “ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE PROTEÍNAS DURANTE EL DESARROLLO CITOPLASMÁTICO DEL OVOCITO” Asuncion Espinosa, Karen Espinoza, Yasna Espinoza, Alex Finkelstein, Eduardo Flores, Alejandra Galindo, Ricardo Gonzalez, Paula Gonzalez, Francisco Guevara, Carolina Gutierrez, Eric Hernandez, Connie Kalwitz.

2. OVOGÉNESIS • Proceso de diferenciación y formación de gametos femeninos (óvulos). • Desde el desarrollo fetal a la adultez. • Meiosis: 4 células. • Cambios citoplasmáticos del ovocito.

3. FOLICULOGÉNESIS • Proceso de formación, crecimiento y diferenciación de folículos. • Folículo de Graff. • Intervienen componentes celulares, de la teca y de la granulosa.

4. PROTEÍNAS PARTICIPANTES • Producen cambios fundamentales para una adecuada fertilización. • Sirven para determinar etapa de maduración. • Técnicas de marcaje (Ej: Wester Blot o inmunohistoquímica)

5. FATORES INVOLUCRADOS EN EL DESARROLLO FOLICULAR TEMPRANO.

8. TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMORDIAL A PRIMARIO.

9. TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMARIO A SECUNDARIO.

10. TERMINO DE “ARRESTO MEIOTICO”. • cAMP: disminuyen sus niveles y se produce desfosforilación de CDK1 (Thr14 y Thr15). Se activa MPF. • MPF: • Ciclin B; casi indetectable, la mayoría en el citoplasma como RNAm. • P34; en altos niveles, la mayoría en citoplasma como proteína.

11. TERMINO DE “ARRESTO MEIOTICO”. • CDC25: desfosforila CDK1. • WEE1/MYT1: fosforila CDK1. • GPR3: aumenta los niveles de cAMP. • RGS2: inhibe la producción de cAMP. • Gi: inhibe adenil ciclasa, con lo que disminuye el cAMP.

12. ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE LA MADURACIÓN DEL OVOCITO Asociada a la producción de energía Funciones Glucosa 6 Fosfato Deshidrogenasa (G6PD) Explica la escasa funcionalidad al término de esta etapa Método de marcaje Incoloro  BCB (-) Prueba de tinción azul de cresol brillante (BCB) Resultados Azul  BCB (+) ¿Motivo? Nos permite establecer la madurez del ovocito

13. (A) The diameter excluding the zona pellucida (DEZ) of an oocyte was measured with cumulus cells; oocyte plasma membrane was brought into the clearest focus under a phase contrast microscope and the DEZ was measured with a micrometer. (B) Four groups of COCs were observed under a microscope after BCB staining: (a) those with a blue color in both the ooplasm and cumulus cells, (b) those showing a blue color in neither ooplasm nor cumulus cells, (c) those with blue color in ooplasm but not in cumulus cells and (d) those with blue color in cumulus cells but not in ooplasm (arrows). (C-E) Oocytes with fully polarized, partially polarized and non-polarized patterns of mitochondrial distribution, respectively (refer to text for detailed description). (F) After double staining, all the nuclei of cumulus cells were stained blue by Hoechst 33342, but only the nuclei of apoptotic cells were stained red by PI and hence looked pink under the fluorescence microscope. (G) A merged picture after Annexin V and PI staining, in which early apoptotic cumulus cells were stained exclusively by Annexin V (green), late apoptotic cells were stained by both Annexin V and PI (red), while necrotic cells were labeled by PI, but were negative for Annexin V.

14. ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE LA MADURACIÓN DEL OVOCITO • Proteccióncontra el daño oxidativo • Glutatión Reducido (GSH) Funciones • Descondensación de la cabeza del espermatozoide A medida que el momento de la ovulación se acerca • Rol importante en el desarrollo embrionario in vitro se ven incrementados los niveles de GSH Inmunohistoquímica, Western Blot,etc ¿Motivo? Indicador de madurez gametogénica

15. PROTEÍNAS EXPRESADAS EN LA MADURACIÓN DEL OVOCITO Balance redox intracelular Peroxiredoxinas Funciones Protección contra el estrés oxidativo Importancia en las etapas finales de la maduración Transición de la etapa de vesícula germinal (VG) a metafase II (MII) en el ovocito Función Ubiquitin carboxyl hidrolasa isoenzima L1 (UBL1) Niveles extremadamente altos en todas las etapas de la maduración In vitro del ovocito del cerdo Espermin sintetasa (SPSY)

16. PROTEÍNAS EXPRESADAS EN LA MADURACIÓN DEL OVOCITO Proteínas de la vía glicolítica Alfa enolasa Triosafosfato isomerasa Preparación para la modificación del metabolismo energético luego de la fecundación ATP sintetasa Cadena beta de la mitocondria Dihidropoamida succinil transferasa Galactoquinasa

17. DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN • Existe un constante interés de los factores productivos, tanto en las ventajas como en las desventajas. • Gran importancia el estudio del desarrollo del ovocito,enfocados en los factores determinantes de su maduración y fecundación . • Falta información mas acabad e integral al respecto. • Métodos de marcaje bastante conocidos como radioinmunohistoquimica o western blot nos permiten realizar una identificación directa de la enzima o proteína. • También se hace necesario utilizar pruebas específicas.

18. DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN • El objetivo es lograr tener una mayor certeza de que el ovocito está listo para ser fecundado. • No todas las sustancias químicas, proteínas y enzimas que se han detectado actúan sobre el ovocito directamente • La mayoría de las proteínas y enzimas detectadas fluctúan a lo largo de las etapas de maduración del ovocito • Variaciones significativas o escasas de la concentración de proteínas. G6PD

19. DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN • Cabe destacar que las reacciones que se producen no sólo dependen de los niveles de una proteínas, hormonas y/o enzimas en un determinado momento.

20. F I N