1 / 17

FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ

FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ. Készítette: Hajdu Csilla. Módszer elve. Fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próba a sejt morfológiájának változása nélkül bejut a sejtbe, ahol specifikusan köt a komplementer target szekvenciához. Alkalmazása.

feivel
Download Presentation

FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ Készítette: Hajdu Csilla

  2. Módszer elve Fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próba a sejt morfológiájának változása nélkül bejut a sejtbe, ahol specifikusan köt a komplementer target szekvenciához

  3. Alkalmazása • Mikroorganizmusok gyors és pontos mennyiségi és minőségi meghatározásra alkalmas • Speciális gének expressziójára • Morfológiáról, szerkezetről,térbeli elhelyezkedésről ad információt

  4. Alkalmazásának előnyei • Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálata • Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebb • Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálható • mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatók

  5. Alkalmazásának hátrányai • Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis intenzitású jelet kapunk • Élő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetni • Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) autofluoreszceniiája gondot okoz  speciális szűrők • rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségű • Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny sávú filter)

  6. Hibridizáció menete 1. A minta fixálása • Sejt átjárhatóvá tétele • Sejt épségének fenntartása • RNS-ek védelme 2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez rögzítés • Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, 80, 100%-os)

  7. Hibridizáció menete 3. Hibridizáció • A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer próba mintához adása 4. A nem hibridizált próba eltávolítása mosással • 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel mosás, majd szárítás 5. A minták értékelése mikroszkóppal • Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálása

  8. Fluoreszcens festékek • Fluoreszcein származékok (pl.: fluoreszcein izotiocianát) • Rhodamin származékokj(pl.: tatrarhodamin izotiocianát) • Cianin származékok: Cy3 – rRNS-hez kötődik, gerjesztés: 550 nm, emisszió: 570 nm • DAPI – DNS-hez kötődik, gerjesztés: 358 nm, emisszió: 461 nm RNS-hez is kötődik: emisszió kb.: 400 nm

  9. Hibridizált Escherichia coli

  10. Hibridizált Escherichia coli

  11. DAPI-val festett Trichosporon cutaneum

  12. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Saccharomyces cereviciae Bacillus subtilis Trichosporon cutaneum

  13. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum Bacillus subtilis

  14. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Bacillus subtilis Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae

  15. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Trichosporon cutaneum

  16. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni Saccharomyces cereviciae Trichosporon cutaneum

  17. Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni

More Related