Métodos microbiológicos para la enumeración e identificación de microorganismos en alimentos

1. Métodos microbiológicos para la enumeración e identificación de microorganismos en alimentos Microbiología de Alimentos Aldo Dueñes Acosta 199419 Asesor: IvanSalmeron Ochoa

2. Métodos de Identificación Microbiana

3. Tinción de Gram • Separar a las bacterias en dos grandes grupos. • –Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.–Safranina.–Una mezcla de alcohol-acetona 1:1. Bacilos Gram + Bacilos Gram -

5. Agar Macconkey • Identificación de enterobacterias que hidrolizan lactosa. • Positivo: color rojo. • Negativo: amarillo por utilización de peptonas ( pH)

6. Agar Sal Manitol • Agar selectivo para aislamiento de estafilococos. • Alta concentración salina. • Indicador sal manitol. • Estafilococos coagulasa + acidifican medio (zona amarilla). • Estafilococos coagulasa – (zona roja o purpura).

7. Agar Salmonella-Shigella • Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigellaspp. • Inhibición Gram + por sales billiares. • Colonias con centro negro, indicativo de producción H2S.

8. Agar Salmonella-Shigella

10. Prueba de Oxidasa • Identificación de la enzima CitocromoC Oxidasa. • Se usa un aceptor de electrones (Tetrametil-p-fenilendiamina o Reactivo de Kovacs). http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/oxidase/oxidase_test/index.html

11. Prueba de Indol • Determinar la capacidad de separar indol a partir de triptófano. • Formación de un complejo rojo, indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído.

12. Prueba Rojo Metilo. • Identificación de bacterias capaces de producir ácidos fuertes de la glucosa. • Uso de un indicador rojo de metilo. • MO + producen ácidos manteniendo un medio de acidez. • MO – producen acetilmetil carbinol neutro aumentando el nivel de pH.

13. Prueba de Catalasa • Degradación de Peróxido de Hidrógeno por medio de la enzima Catalasa. H2O2 Catalasa H2O + O2

14. Prueba OF • Prueba de Oxidación Fermentación. • Utilizando Dos tubos con indicador azul de brotimol. • Al inocularse ambos tubos, uno con tapa semi cerrada y otro se agrega aceite y se cierra completamente. • El vire de color por pH indica presencia de acido.

15. Prueba Fermentación de Hidratos de Carbono • Determinar la capacidad de un Mo parafermentar CHOs paraproducirácido c/s gas. • Indicador Azul de Bromitinol • Indicación de producción de gas se utilizacampana Durham.

16. Prueba MIO • Identificación Enterobacteriaceae en base a Movilidad, Actividad de OrnitinaCarboxilasa y Producción de indol. • Movilidad.- Entubecimiento del medio. • Ortonina.- Indicador purpura de bromo cresol. • Positivo: color purpura. • Negativo: color amarillo. • Indol.- Adición reactivo de kovacs.

17. Prueba TSI • Diferenciación de enterobacterias en base a fermentación , con producción de gas y determinar la producción de ác. Sulfhídrico. • Agar Triple a Azucar. Lactosa, Glucosa y Sacarosa. • Rojo de Fenol indicador. • Producción de Tiosulfato de Sodio produce un oscurecimiento.

18. Prueba TSI Pico alcalino, fondo ácido (R/A): MO fermenta G Pico Acido, Fondo ácido: (A/A): MO fermenta G-L Pico alcalino, fondo alcalino (R/R): MO no fermenta azúcares. Presencia de burbujas o ruptura del medio, producción de gas. Ennegrecimiento del medio, producción de ácido sulfhídrico.

19. Prueba LIA • Diferenciar MO, especialmente, Salmonella por descarboxilación/desaminación de Lisina, y producción ác. Sulfhídrico. • Indicador Purpura de Bromocresol. • Amarillo cond. Ácidas. • Violeta condiciones Básicas. • Descaboxilación de lisina produce amina cadaverina, produce viraje purpura. Descaboxilación en medio ácido inducido por fermentación. • Desaminación de lisina produce ácido alfa-ceto-carbonico, dormando color rojizo por sal de hierro y presencia de oxideno. • Ac. Surfhídrico reacciona para producir sulfuro de hierro oscureciendo el medio.

20. Prueba LIA Descaboxilación Positiva : Pico Violeta / Fondo Violeta Negativa: Pico Violeta / Fondo Amarillo Desaminación: Pico Rojizo / Fondo Amarillo Ennegrecimiento del medio, producción de ácido sulfhídrico.

21. Prueba Agar citrato • Identificación de bacterias mediante la utilización de citrato. • Indicador Azul de bromotinol.

22. Prueba Urea • Identificación de Mo por actividad de la enzima eureasa. • Indicador rojo de fenol. • Medio ácido: color amarillo • Medio alcali: color rojo. • Conversión de la urea a amoniaco e hidrógeno, produciendo un medio alcali.

23. Interpretación de Resultados.

24. Métodos de numeración de MO. • Realiza el conteo total de microorganismos presentes en el alimento. • Se considerara un indicador de las características higiénicas generales del alimento. • Los microorganismos por analizar serán miembros de poblaciones diferentes. • Características del medio utilizado. • Condiciones de incubación.

25. Cuenta Placa • Una muestra es pipetiado en una caja petriesteril mezclándose con un agar. • Agar a temperatura de 40°, evitar shock termico. • Es aceptado una cuenta de 25-250 colonias. • Recomienda realizar disoluciones antes de la numeración, para obtener cuanta deseada. • Para obtener mayor confianza, duplicar los resultados. X= media de colonias V= volumen d= disolución

26. Número más Probable • Inoculación de tubos con diferentes tamaños de muestra. • Se realiza con replicas (3,4,5). • Por medio de tablas se determina el número máximo en un lote.

28. Foodmicrobiology

29. Método de Tinción. • Usado en la industria láctica. • Teñido por redox. Toma e de los sistemas bioquimicos activos, cambiando de color. • Las sustancias más usadas son: • Azul de metilo. • Resazurina.

31. Filtro por membranas • Membranas porosas que retienen a las bacterias. • Una vez retenidas son inoculadas en un agar para su posterior conteo.

32. Filtro de epifluorecencia directa • Variacion del método de filtro. • Usando teñidores y microscopio fluorecentes.

33. Microcolonias en DEFT • Una variación del Filtrado de epifluorecencia, son filtradas , inoculadas e incubadas. • Determina células viables únicamente. • Observación por microscopio. • Dependiendo del periodo de incubación seran detectados lo microorganismos. • Gram – 3 hrs. • Gram + 6 hrs. • Coliformas, pseudomonas, staphyllococos 8 hrs. DirectEpifluorescentFilterTechniques

34. Cuenta colonias por Microscopio. • Recuento de colonias de un agar sobre un portaobjetos, previamente inoculado y encubado.

35. Goteo de agar • Gotear una muestra mezclada con cultivo en caja petri vacía. • Realizar disoluciones y proceder con el goteo en otra caja petri.

36. Películas secas • Dos películas plásticas juntas, una de ellas contiene el medio de cultivo y un agente gelificante soluble en agua fría. • Muestra diluida se coloca entre las películas, se realiza la incubación. • Las microcolonias se colorearan por la acción de tetrazolium durante la fase de teñido.

37. Tubos rodantes • Efectivo para conteo de bacterias anaerobias. • Tubos con agar fundido e inoculado a in tubo con rosca,

38. Bibliografía • Adams M., Moss M. (2000) FoodMicrobiology, 2nd Edition, UK., Real Society of Chemistry. • Jay J. (2000) Modern FoodMicrobiology, 6th Edition, USA, Aspen Publishers. • Miramontes S. Manual de Laboratorio de Microbiologia General, UACH, Facultad de Ciencias Químicas. • Virtual InteractiveBacterologyLaboratory Michigan StateUniversity http://learn.chm.msu.edu/vibl/index.html

39. Gracias