Synthèse et évaluation de modulateurs de la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator)

1. Synthèse et évaluation de modulateurs de la protéine CFTR(Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) Soutenance de thèse de Benjamin Boucherle Le 9 décembre 2008 Directeur de thèse : Pr. Jean-Luc DECOUT Projet financé par l’association « Vaincre La Mucoviscidose »

2. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

3. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

4. Contexte Scientifique Travaux antérieurs Mise en évidence d’une nouvelle réaction • entre : • Méthylglyoxal (MG) 1 • α-aminoazahétérocycle 2 • Adduits de deux molécules de MG sur l’hétérocycle Thèse C. Routaboul 2003 C. Routaboul et al. Chem. Comm. 2002 1

5. Contexte Scientifique Travaux antérieurs Mise en évidence d’une nouvelle réaction • Accès à une nouvelle famille d’hétérocycles (Famille I) • Réaction stéréosélective et régiosélective • Obtention de deux mélanges racémiques majoritaire a et minoritaire b Dans la suite de la présentation, un seul énantiomère du mélange racémique sera représenté 1

6. 81 % Contexte Scientifique Travaux antérieurs Réactivité en milieu basique • Adduits MG-2-aminopyridine 3 • Formation : • 2-aminopyridine de départ 5 • Nouveau composé 4 (famille II) issu de trois réactions en une seule étape : • Décarboxylation • Déshydratation • Oxydation 2

7. Contexte Scientifique Travaux antérieurs Activité biologique des nouveaux composés • Parenté structurale entre • Le composé de la famille II 4 • Et un modulateur connu (MPB-07) de la protéine CFTR Evaluation de l’effet des composés des familles I et II sur la protéine CFTR 3

8. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

9. Contexte Scientifique La protéine CFTR Structure • Super famille des transporteurs ABC (ATP Binding Cassettes) qui comprend également P-gP et MDR • Canal Chlorure • 1480 acides aminés • Répartis en deux séquences reliées par un domaine régulateur (R) • comportant chacune : • 6 domaines transmembranaires (MSD) composant le canal ionique • 1 domaine de fixation aux nucléotides (NBD) 4

10. Contexte Scientifique La protéine CFTR Localisation, Fonctions et Régulation • Localisée sur la face apicale des épithéliums polarisés • Fonctions • Canal Chlorure • Grâce à l’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP sur les NBD • Régulation d’autres canaux ioniques • Régulation en fonction du taux de phosphorylation du domaine R dépendant de la concentration en AMPc 5

11. Contexte Scientifique La protéine CFTR Pathologies impliquant la protéine CFTR • Diarrhées sécrétoires (Choléra) • Suractivation de la protéine CFTR • Mucoviscidose (Cystic Fibrosis) • Inhibition ou abolition de la fonction canal Cl- 6

12. Contexte Scientifique La protéine CFTR La mucoviscidose • Maladie génétique autosomique récessive • La plus fréquente dans les populations d’origine caucasienne • Mutations du gène codant pour la protéine CFTR (plus de 1500 mutations décrites) • Symptômes • Nombreux et variables, principalement pulmonaires et digestifs • Peu ou pas reliés au génotype • Traitements actuels uniquement symptomatiques et préventifs Nécessité d’un traitement curatif 7

13. Contexte Scientifique La protéine CFTR Les différentes classes de mucoviscidose • Six classes • Principale mutation : • ΔF508 ou delF508 • Synthèse d’une protéine non adressée à la membrane • Classe II 8

14. Contexte Scientifique La protéine CFTR Perspectives thérapeutiques de la mucoviscidose • Thérapie génique • Restauration du transport ionique par activation de transporteurs autres que CFTR • Thérapie protéique • « Through-reading » : classe I • Correcteurs : classe II • Activateurs de CFTR : classes II (en association avec un correcteur) III, IV et V 9

15. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

16. Contexte Scientifique Les modulateurs de CFTR Modulation de la protéine CFTR • Type de modulation : • Action sur le système de régulation de CFTR (Kinases, AMPc) • Action directe sur la protéine • Activateurs/Potentiateurs : traitement potentiel de la mucoviscidose • Activateurs : actifs sans préactivation de CFTR par le système AMPc • Potentiateurs : nécessitent une préactivation pour être actifs (Phosphorylation du domaine R) • Inhibiteurs (outils pharmacologiques) 10

17. Contexte Scientifique Les modulateurs de CFTR Les activateurs / potentiateurs de CFTR • Très nombreux, de classes chimiques très variées • La plupart sont moyennement actifs (activation à des concentrations autour du µM) et non sélectifs • Un essai clinique en cours : • VX-770 • Phase II • Sur patients portant la mutation G551D (Classe III) L’activation de CFTR est une perspective thérapeutique prometteuse 11

18. Ma et al. J Clin. Invest. 2002 Contexte Scientifique Les modulateurs de CFTR Les inhibiteurs de CFTR • Très nombreux, de classes chimiques très variées • La plupart sont moyennement actifs (inhibition à des concentrations autour du µM) et non sélectifs • Le plus intéressant en tant qu’outil pour l’étude de CFTR est CFTRinh-172 • Sélectif et assez actif IC50 (CHO-wt) = 1 µM • Mais peu soluble dans l’eau et inactif sur tissus Nécessité de développer d’autres inhibiteurs de CFTR 12

19. Contexte Scientifique Les modulateurs de CFTR Les modulateurs développés au laboratoire • Collaboration avec l’équipe : • Physiopathologie et Pharmacologie des Canaux ionique (UMR 6187), Pr F. Becq • Evaluation par le test d’efflux d’ions iodures radioactifs • Mesure de la vitesse de sortie des ions iodures en présence des composés à tester • Mise en évidence d’un potentiateur • GPact-11a : EC50 (CHO-wt) = 2,1 µM • Composé de la famille I • Adduit MG-9-propyladénine 13

20. Contexte Scientifique Les modulateurs de CFTR Les modulateurs développés au laboratoire • Mise en évidence de plusieurs inhibiteurs dont : • Le composé 4 de la famille II : IC50 (CHO-wt) = 5,1 nM • GPinh-5a : IC50 (CHO-wt) = 71 pM • Composé de la famille I • Adduit MG-2’-désoxyadénosine 14

21. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

22. Objectifs Objectifs • Poursuite des études biologiques sur les composés actifs • Identification du pharmacophore • Pharmacomodulation des composés actifs 15

23. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

24. Résultats Evaluations Biologiques Poursuite de l’évaluation biologique • Validation du potentiel thérapeutique des modulateurs ou de leur intérêt en tant qu’outils • Nécessité d’obtention de quantités importantes • Synthèses à plus grande échelle • Optimisation des purifications • Changement de phases de chromatographie 16

25. 4 GPact-11a GPinh-8ab 4 GPinh-15ab GPinh-5a GPact-11a GPinh-5a Résultats Evaluations Biologiques Toxicité • Cellulaire (Test au MTT) • Pas de toxicité des molécules testées • Génétique (Test d’Ames) • Pas de toxicité des molécules testées sauf 4 composé de la famille II • Induction d’enzymes hépatiques (Cyt P450) • Pas d’induction par les molécules testées 17

26. 4 GPact-11a GPinh-8ab 4 GPinh-15ab GPinh-5a GPact-11a GPinh-5a GPinh-5a Résultats Evaluations Biologiques Sélectivité • Autre transporteur ABC : MRP1 • Pas d’effet des molécules testées • Canaux non-chlorures : les canaux cardiaques potassiques (Herg), sodiques et calciques • Pas d’effet des molécules testées • D’autres canaux chlorures : les canaux calcium- et volume-activés • Pas d’effet de GPinh-5a 18

27. GPinh-8 GPinh-5 GPinh-15 GPinh-17 GPinh-18 Résultats Evaluations Biologiques Influence de la stéréochimie • Principaux inhibiteurs C. Routaboul et al. JPET 2007 19

28. Résultats Evaluations Biologiques Evaluation sur différentes mutations de CFTR C. Routaboul et al. JPET 2007 20

29. Résultats Evaluations Biologiques Evaluation sur différentes mutations de CFTR C. Routaboul et al. JPET 2007 20

30. Résultats Evaluations Biologiques Evaluation sur différentes mutations de CFTR C. Routaboul et al. JPET 2007 20

31. Résultats Evaluations Biologiques Evaluation sur différentes mutations de CFTR C. Routaboul et al. JPET 2007 20

32. Résultats Evaluations Biologiques Evaluation sur différentes mutations de CFTR C. Routaboul et al. JPET 2007 20

33. Résultats Evaluations Biologiques Test en chambre de Ussing • Test tissulaire • Mesure de l’intensité du courant transépithélial • Sur intestin de souris • Inhibiteur GPinh-5a • Inhibe dès 20 pM • Nécessite une préincubation • Activateur GPact-11a • EC50 de 135 µM après stimulation par la forskoline • EC50 de 256 µM sans stimulation par la forskoline GPact-11a n’est pas seulement un potentiateur mais également un activateur 21

34. Résultats Evaluations Biologiques Test in vivo • Sur la salivation de souris (collecte de la salive produite) • Après stimulation et en présence des modulateurs • Inhibiteur GPinh-5a • Inhibe dès 20 pM • Nécessite une préincubation • Activateur GPact-11a • EC50 de 7,2 µM après stimulation • Inactif sur souris KO (CFTR -/-) 22

35. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

36. Résultats Recherche du pharmacophore Simplifications structurales • Petites molécules contenant le pharmacophore • Modifications de la famille I • Modification des groupements méthyles • Famille II • Décarboxylation 23

37. Résultats Recherche du pharmacophore Sélection de molécules • Comprenant le pharmacophore supposé 24

38. IC50 (CHO-wt) = 96 µM IC50 (CHO-wt)= 1 mM IC50 (CHO-wt)= 220 µM IC50 (CHO-wt)= 25 µM IC50 (CHO-wt)= 4 µM Résultats Recherche du pharmacophore Activités • Aucun potentiateur • 5 composés inhibiteurs • 2 atomes de carbone entre les hétéroatomes • Conforte la structure du pharmacophore proposé 25

39. Résultats Recherche du pharmacophore Modification des groupements méthyles • Changement de l’α–oxoaldéhyde : éthylglyoxal (EG) • Résultats antérieurs : • Réaction entre : l’éthylglyoxal et la 2-aminopyridine • Formation d’adduits voisins de ceux du MG • Extension de la réaction aux adduits EG-1-aminoisoquinoléine 26

40. Résultats Recherche du pharmacophore Influence de l’α-oxoaldéhyde (MG Vs EG) • Remplacement des groupements méthyles par éthyles compatible avec l’activité (encombrement) • Adduit EG-2-aminopyridine : IC50 (CHO-wt) = 18 µM • Influence de la lipophilie ? 27

41. Résultats Recherche du pharmacophore Nouveaux composés de la famille II • Extension de la réaction à 3 nouveaux adduits : • Adduits MG-1-aminoisoquinoléine • Adduits MG-benzamidine • Adduits EG- 2-aminopyridine • Produits attendus non obtenus à partir des adduits MG-dérivés de l’adénine (GPact-11a et GPinh-5a notamment) 28

42. 48 % (2 étapes) IC50 (CHO-wt) = 5 nM IC50 (CHO-wt)= 17 nM Résultats Recherche du pharmacophore Famille II • Voie d’accès à des pyrimidines substituées • 2 composés inhibiteurs • Confirmation du pharmacophore 29

43. Famille I GPact-11a Famille III Résultats Recherche du pharmacophore Accès à un nouveau type de composés : Famille III • Essai de modification des adduits de la famille I en milieu basique • Différent de NaOH : tBuOK • Mise en évidence d’une nouvelle famille de composés • Résultant d’une décarboxylation des adduits de la famille I • Evaluation sur CFTR en cours 30

44. Résultats Recherche du pharmacophore Formation des composés de la famille III • Stéréochimie des composés • Deux isomères observés par spectrométrie de RMN • Deux diastéréoisomères • Ou deux mélanges racémiques • Le même mélange d’isomères est obtenu • A partir du mélange racémique majoritaire a de la famille I • A partir des deux mélanges racémiques a et b 31

45. Résultats Recherche du pharmacophore Proposition de mécanisme • Déprotonation • Elimination du carboxylate • Arrachement concerté du proton en α • Reprotonation 32

46. Résultats Recherche du pharmacophore Proposition de mécanisme • Deux mélanges racémiques • A partir du mélange racémique majoritaire a de la famille I • A partir des deux mélanges racémiques a et b 33

47. Plan • Contexte scientifique • Travaux antérieurs • La protéine CFTR • Modulation de la protéine CFTR • Objectifs du travail • Résultats • Poursuite de l’évaluation biologique des premiers composés actifs • Recherche de nouveaux composés actifs • Recherche du pharmacophore • Pharmacomodulation • Conclusions et perspectives

48. GPact-11a GPinh-5a Résultats Pharmacomodulation Structure des « chefs de file » et voies de synthèse • Le meilleur inhibiteur et le potentiateur diffèrent uniquement par le groupement en position 9 • Modifications de l’adénine en position 7 ou 9 et/ou 8 et/ou 2 34

49. Résultats Pharmacomodulation Modulations réalisées 35

50. Lors de la réaction avec le MG Formation des adduits attendus Et d’adduits ne portant plus le 2’-désoxyribose Difficultés de purification Accès à des dérivés de l’adénine modifiée en position 8 Résultats Pharmacomodulation Dérivés de la 2’-désoxyadénosine 36