1 / 29

N eophodne u mnogim naučnim oblastima:

ELISA i srodne analize. ( enzyme linked immuno sorbent assay ). Gde se koriste ove metode?. N eophodne u mnogim naučnim oblastima:

fleur
Download Presentation

N eophodne u mnogim naučnim oblastima:

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ELISA i srodne analize (enzyme linked immuno sorbent assay) Gde se koriste ove metode? • Neophodne u mnogim naučnim oblastima: • imunologiji,endokrinologiji i neuroendokrinologiji, molekularnoj biologiji, virusologiji, farmakologiji, kao i u drugim oblastima istaživanja vezanim za reprodukciju… • koriste za određivanje velikog broja supstanci u uzorcima različitog porekla (krvni serum, mleko, plazma, tkivo...): peptidnih hormona, ne-peptidnih hormona, cikličnih nukleotida, imunoglobulina, lekova, virusnih proteina, enzima.

  2. RIA prve u nizu… • zasnivaju se na originalnim zapažanjima Yalowu i Bersona (1953) da male koncentracije antitela na insulin mogu da se detektuju zahvaljujući njihovoj sposobnosti da vezuju radioaktivni insulin (insulin obeležen I-131).

  3. Radioimunološka analiza (RIA) je zbog svoje preciznosti našla široku primenu u mnogim zemljama, ali naučnici nisu prestali da rade na iznalaženju još podesnijih metoda koje ne bi zahtevale posebne laboratorije, skupe instrumente i korišćenje radioizotopa. • Otkrićem enzimimunoloških metoda (EIA) za odredjivanje koncentracije supstanci kao što su hormoni, imunoglobulini, lekovi i dr. u tome se donekle i uspelo. Ove metode se zasnivaju na istom principu, samo što je kod RIA antigen obeležen radioizotopima, a kod EIA određenim enzimom.

  4. ELISA ELISA RIA van Weemen, BK Clinical Chemistry, 51, 12, 2005.

  5. ELISA - princip metode • Osnovna karakteristika metode je“obeležavanje"jedne od komponenti enzimom: • Ag ili • Ab: tzv. primarno Ab (1st Ab) ili sekundarno Ab (2nd Ab) • Aktivnost enzima u kompleksu određuje se na osnovu indikatorske reakcije tog enzima sa određenim supstratom koji se dejstvom enzima transformiše u bojeni produkt. • Postoje kompetitivni tip analize i nekompetitivni sendvič - tip analize koja se najčešće koristi kod određivanja koncentracije proteinskih hormona.

  6. Ag+ Ab AgAb + standard ili antigen iz uzorka Ag Ag Ab Ag+ AbAgAb standard iliantigen iz uzorka ELISA - princip metode 1) kompetitivni tip 2) ne-kompetitivni tip "obeležen Ag ili Ab"

  7. Metoda je visoko specifična: • zbog mogućnosti primeneuskospecifičnih Ab • posebno prečišćenih stabilnih enzima jednostavne kinetike (alkalna-fosfataza, -D-galaktozidaza, peroksidaza rena) • korišćenja jasno definisanih supstrata i hromogena(supstanci koje daju bojeni produkt, ili produkt koji se karakteriše fluorescencijom, odnosno luminescencijom) • količina nastalog produkta meri se fotometrom, odnosno fluorometrom ili luminometrom • metoda ima veliku osetljivost, lako se primenjuje i ima mogućnost merenja malih koncentracija Ag u biološkom materijalu

  8. Kompetitivni tip analize • 1st Ab fiksirano za podlogu • kompetituju Ag (standard ili uzorak) i Ag obeležen enzimom • + supstrat =boja Količina bojenog produkta obrnuto srazmerna količini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive).

  9. Nekompetitivni sendvič-tip analize • 1st Ab fiksirano • dodaje se Ag (standard ili uzorak) • drugi put 1st Ag • 2nd Ab obeleženo enzimom • Količina bojenog produkta srazmerna količini antigena u standardu, odnosno uzorku (videti grafik standardne krive)

  10. Nekompetitivni sendvič-tip analize • 1st Ab fiksirano • dodaje se Ag (standard ili uzorak) • 1st Ab obeleženo enzimom

  11. FIA Fluorescentno-imunološkeanalize Osnovna karakteristika metode je Ag ili Ab obeleženo supstancom koja fluorescira, npr. Eu Stepen fluorescencije meri se fluorimetrom. Kao i kod ELISA testa postoje kompetitivni i ne-kompetitivni tip analize.

  12. DELFIA za progesteron i tiroksin kompetitivni tip analize

  13. DELFIA komplet za TSH ne-kompetitivni sendvič tip analize Dva antitela protiv različitih antigenih determinanti na antigenu. Jedno antitelo vezano za čvrstu fazu i za njega se vezuje jedna antigena determinanta molekula TSH, a drugo je obeleženo Eu i ono se vezuje za drugu antigenu determinantu istog molekula. Dodavanjem odgovarajućeg rastvora dolazi do oslobađanja jona Eu i formiranja fluorescentnog signala koji je proporcionalan koncentraciji hormona u standardu, odnosno uzorku.

  14. Primer protokola-DELFIA za progesteron

  15. Nema problema sa NSB • Nespecifično vezivanje obeležene komponente za čvrstu podlogu minimalno • U mnogim komercijalnim kompletima se ne odredjuje. • Postoje kompleti gde se to radi.

  16. Kontrola kvaliteta imuno analiza Antitela – velika specifičnost (unakrsna reakcija) i veliki afinitet prema antigenu Standardi: Antigen standarda i antigen iz uzorka moraju da reaguju identično sa specifičnim antitelima Koncentracijski opseg između najvećeg i najmanjeg standarda mora biti dovoljno širok da obuhvati najveći broj očekivanih koncenracija antigena u uzorku. Odnos između pojedinih standarda kao i odnos između celokupnog koncentracijskog opsega i radnog razblaženja antitela, mora da bude takav da određivanje koncentracije antigena u uzorku bude precizno u svakom delu standardne inhibicione krive

  17. Optimizacija analize • Homolog (sve komponente od iste vrste) i heterolog sistem (pr. pacovski LH antigen, govedji anti-LH serum, standard pacovski LH • Radni rastvor Ab vezuje 30 -50 %Ag u odsustvu Ag • Ag koncentracija manja od najmanjeg standarda (zbog osetljivosti) • Radni opseg standardne krive : 15 – 90% od B0 • Puferski sistemi, inertni protein-nosači, aditivi, konzervansi... • Vreme inkubacije, temperatura, zapremina inkubacionog sistema (mikrotitar ploče)

  18. S • Kontrola kvaliteta: • Specifičnost-napravi se standardna kriva za datu supstancu i odrediED50 Primer: RIA za estradiol , kros-reakcija estrona na antitelo za estradiol kros-reakcija = • Osetljivost – ona koncentracija standarda gde je B za 10% manje od B0 • Preciznost – izračunavaju se koeficijenti varijacije unutar eseja i izmedju dva eseja • Tačnost – odredjuje se na dva načina - test paralelizma - uzorak + ED50 (estradiola) x 100 ED50 (estrona)

  19. ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

  20. ELISA -Kompetitivni tip analize za cAMP

  21. Biohemija Acetilholinesteraze

  22. Acetilacijaipriprema uzoraka

  23. Preračunavanje preko standardne krive

  24. AgAb AgAb S Preračunavanje preko standardne krive S apsorbanca S

  25. Osnovni pojmovi koje treba da znamo: B – količina Ag* koji je formirao kompleks sa Ab T– ukupna količina Ag*i predstavlja B+F B0 – maksimalno vezivanje Ag*za Abu odsustvu neobeleženog Ag NSB-nespecifično vezivanje • Prisustvo neobeleženog antigena inhibira formiranje obeleženog kompleksa. Stepen inhibicije je srazmeran količini neobeleženog antigena. • Da bi odredili nepoznatu koncentraciju Ag, stepen kompetitivne inhibicije u nepoznatom uzorku poredimo sa stepenom kompetitivne inhibicije standarda. • Izražava se najčešće odnosom: B/B0

  26. Modeli standardne krive Y Logit-ln model: x-osa S y-osa odgovor (Y) S Y logyt Y = ln 100 - Y B - NSB Y = x 100 B0 - NSB logyt Y = a + b lnX 1 b Y X = e 100 - Y Mogućnost očitavanja sa standardne krive zasniva se na POSTOJANJUPARALELIZMA izmedju standardne krive i inhibicione krive uzorka. Paralelizam postoji ukoliko antigen-standard i antigen iz uzorka pokazuju istovetno ponašanje u odnosu na vezivanje za antitelo. a - b

More Related