RNA DE INTERFERÊNCIA E CÂNCER

1. RNA DE INTERFERÊNCIA E CÂNCER Genética Humana Molecular Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

2. CLASSES DE RNA RNA não codificadores (ncRNA) RNA codificador RNA funcionais RNA pequenos Codifica proteínas: mRNA (3%) snRNA(small nuclear): processamento de RNA transcritos (spliceossomo) snoRNA (small nucleolar): modificação do rRNA miRNA (micro): regulação da expressão gênica siRNA(small interfering): defesa do genoma contra vírus e transposons Não traduzidos: tRNA (15%) rRNA (70%) lncRNA: 200 nt ~100 kb, expressão tecido-especifica, regulação alterada em várias doenças e câncer

3. ncRNA longos • lncRNA: conteúdo no genoma humano varia de ~7000 - 23,000 • Função: imprinting e inativação do X • Representa um enorme componente da rede celular normal que pode ser alterada na biologia do câncer. Gibb et al. Molecular Cancer 2011, 10:38

4. Compreende um grupo de vias relacionadas mecanisticamente que produzem moléculas de ncRNA pequenas, as quais modulam a expressão protéica via degradação do mRNA ou repressão da tradução. SILENCIAMENTO DO DNA

5. RNA de interferência iRNA mecanismo exercido por moléculas de RNA complementares a mRNA, o qual inibe a expressão gênica na fase de tradução ou dificulta a transcrição de genes específicos miRNA (microRNA) siRNA (small interfering RNA)

6. Andrer Fire e Craig C. Mello (2006): Prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina sobre RNA interference em C. elegans, publicado em 1998.

7. microRNA - Histórico • Ambros et al (1993): descobriram o gene lin-4 (small non-protein-coding RNA)  regulação do desenvolvimento larval de Caenorhabditis elegans • Identificação de ~1049 microRNAs (miRNAs)  20-22 nucleotídeos  não codificadores de proteínas • Reguladores negativos da expressão gênica • Regulam >60% de RNAm: função em processos como desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular, apoptose e resposta a estresse • Presentes em: C. elegans, D. melanogaster, plantas e mamíferos (humanos) • miRNA: implicados em vários cânceres humanos  tanto perda como ganho de miRNA  contribuem para o desenvolvimento do câncer

8. O que são microRNAs? • Pequenos RNAs endógenos fita simples não codificadores de proteínas, com tamanho de ~ 19-25 nucleotídeos. • Potentes reguladores pós-transcricionais. • Função: • -proliferação • -diferenciação • -apoptose • -carcinogênese: duplo papel (oncogênese e supressor tumoral)

9. miRNA x siRNA • siRNA • Derivam de mRNA de transposons, vírus ou DNA heterocromático • Processados a partir de grandes duplexes • Ambas cadeias são aproveitadas no RISC • Raramente conservados • siRNA endógenos especificam autosilenciamento (silenciamento do mesmo locus) que o originou • miRNA • Derivam de loci genômico distintos (introns, exons, regiões intergênicas) • Processados a partir de RNAs em grampos: precursor forma alças  dupla hélice c/hairpin; forma madura: linear (fita sem alças) • Apenas a fita madura 3’ incorporada ao RISC, a outra 5’ degradada • Permanece intacto após cisão do mRNA alvo (pode se ligar em outras regiões) • Conservado entre os organismos Não se distinguem pela sua composição química ou mecanismo de ação, diferenciam pela origem e alvos.

10. Comparação entre miRNA x siRNA http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101007/100705.pdf

11. NOMENCLATURA dos miRNA • designados pelo prefixo miR e um único número de identificação • Ex: miR-1, miR-89, miR-278 • Os genes que codificam os miRNA são também denominados com o mesmo prefixo de três letras com letras maiúsculas, hifenização (-) e itálico, consoante dos organismos • Ex: MIR -156 no Aridopsis e mir-1 na Drosophila. • Os precursores miRNA (pré-miRNA) têm habitualmente a designação mir, • as formas maduras miRNA são designadas miR • miRNA maduros cuja sequência difere em uma ou em duas posições são designados com sufixos com letras pequenas, • Ex: miR-1a e miR-1b http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101007/100705.pdf

12. Biogênese do microRNA Gene miRNA (localizado em introns e região intergênica) miRNA: gerado pela transcrição de um longo precursor (pri-miRNA)  pela RNA pol II processado para produzir um segundo precursor (pre-miRNA) 60-100 nt. Transportado (Exportina 5)  citoplasma processado RNase III(Dicer)  remoção hairpin miRNA duplex (~22nt)  complexo RISC  fita simples linear Ligação 3’UTR RNAm  inibição tradução Cell. Mol. Life Sci. (2011) 68:2859–2871

13. PRODUÇÃO E PROCESSAMENTO DO miRNA Apenas uma fita madura (guia 3’) é incorporada ao RISC, outra (passenger 5’) degradada. Sequência seed: região de 2-8nt do final 5’ do miRNA, importante p/ reconhecimento e silenciamento do mRNA Beezhold et al. Molecular Cancer 2010, 9:134

14. ANIMAÇÃO miRNA - NATURE http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

15. BIOGENÊSE DOS miRNA e siRNA verde: cadeia passenger azul: cadeia guia Preto: seq. clivada a)pri-miRNA forma hairpin  reconhecido DGCR8 (double-stranded RNA-binding protein) e clivagem 11pb distante pela Drosha b-c)pre-miRNA e siRNA são clivados pela Dicer  formando miRNA duplex d)complexo Dicer-dsRBP retem o produto maduro  levado p/ Ago (efetor de RISC-RNA-induced silencing complexes) e) após ligação ao duplex a cadeia passenger (verde) é removida e a guia (azul) permanece ligada a Ago f-g) RISC ativado dirige-se p/o mRNA alvo Current Opinion in Structural Biology 2010, 20:90–97

16. miRNA x siRNA

17. REGULAÇÃO POR miRNA • 1 miRNA pode regular ~200 mRNA (múltiplos alvos) • 1/3 dos genes estão sob controle dos miRNA. Ex.: genes de fatores de transcrição • Genes de miRNA: banco de dados www.sanger.ac.uk/ • > 700 miRNA em humanos • 70% dos genes de miRNA localizados em introns e exons • 30% localizados em regiões intergênicas

18. Mecanismos de Regulação pelos miRNA Três processos: 1- clivagem endonucleolítica: requer complementaridade perfeita ou quase perfeita ao mRNA (raro em mamíferos, devido interação incompleta entre miRNA-mRNA) 2- degradação do mRNA por deadenilação: repressão da tradução da proteína; 3- inibição do início da tradução

19. MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO • PTGS (Postranscriptional gene silencing) • Atua em nível do mRNA através do mecanismo dependente de Argonauta-2 (Ago-2) • Referido como RNA de interferência (RNAi) • siRNA atua para recrutar Ago-2 para o mRNA alvo pela complementaridade da sequência • Resulta na clivagem ou repressão traducional do mRNA alvo • Consequente diminuição da expressão gênica • Depende da presença continua do siRNA • TGS (Transcriptional gene silencing) • Atua em nível de DNA e pode resultar em silenciamento a longo tempo • Envolve mudanças na cromatina mediada por ncRNA na região promotora resultando em transcrição reduzida de genes alvos • Modificações da cromatina: metilação do DNA e histonas • Observado em plantas, drosophila, levedura e humanos • Utilização com siRNA sintéticos

20. NATURE|Vol 457|22 January 2009|doi:10.1038/nature07758 MECANISMOS DE SILENCIAMENTO GÊNICO • Mecanismos:ligação naregião 3’UTR do RNAm (a) • pós-transcricional (PTGS): • clivagem direta do RNAm: miRNA é complementar ao RNAm  degradado após clivagem p/RISC • -repressão da tradução e degradação RNAm: miRNA com pareamento incompleto DGCR8: cofator de DROSHA XPO5: exportinA-5 (transporte ao citoplasma) RISC (RNA-induced silencing complex)

21. Modelo de silenciamento gênico do tipo TGS Recrutamento de Ago-1promotor siRNA sintético ou miRNA endógeno Plasmídeo expressando shRNA ou RNA antisense Recrutamento de HDAC-1, DNMT3A, HMT cromatina fechada transcrição inativa BioTechniques 48:ix-xvi (The RNA World June 2010) doi 10.2144/000113442

22. Mecanismos de repressão mediado por miRISC (Topo) RNAm não reprimidos recrutam fatores de iniciação e ribossomos e formam estruturas que aumentam tradução. Esquerda (superior): Ligação de RISC ao RNAm  pode reprimir iniciação pelo reconhecimento do cap; Esquerda (inferior): ou recrutamento de 60S. Bottom: Alternativamente: pode induzir deadenilação do RNAm  inibir circularização do RNAm Direita (inferior): reprimir estágio pós-iniciação da tradução  retirada dos ribossomos prematuramente; ou promover degradação do RNAm induzindo deadenilação e remoção do cap

23. microRNA e Câncer • Descoberta de miRNA câncer: • LLC: del(13q14)  dois genes de miRNA: miR-15-a e miR-16-1  perda em 70% de LLC  evento precoce (iniciador)  função de gene supressor de tumor • Maioria dos miRNA localizados em regiões envolvidas em alterações cromossômicas: • deleções, • Amplificação, • mutação (afeta o processamento dos miRNA), • Metilação (ilhas CpG dos promotores)

24. www.nature.com/reviews/genetics OCTObER 2009 | VOLuME 10 Mapa de miRNA envolvidos em alterações em câncer:13q14 (miR-15-a e miR-16-1)- deletada em LLC; 7q32 (miR-29-a e miR-29b) deletada em SMD e LMA; 3p2 (let-7g-let-7a1); 9q22.3 (let-7f-1-let-7d) em tumores sólidos (pulmão, urotelial, mama, etc.

25. Função dos miRNA como supressor tumoral x oncogene Sequenciamento dos miRNA: evidenciado deleções, mutações (inclusive na linhagem germinativa  forma familial de LLC) Membros da família let-7 regula negativamente Oncogene RAS Perda de let-7 expressão > de RAS Câncer de pulmão miR-15-a e miR-16-1alveja oncogene BCL2 (inibidor apoptose) Perda desses miRNAs  disfunção de oncogenes celulares miR-17-92 (13q31) promove proliferação, inibe apoptose, induz agiogênese, e coopera c/ MYC  desenvolvimento de linfomas e câncer pulmão Overexpression miR-155 pobre prognóstico em adenocarcinoma pulmão miR-155 e miR-17-92: amplificados em vários linfomas de células B, câncer pulmão, mama, etc

26. www.nature.com/reviews/genetics OCTObER 2009 | VOLuME 10

27. miRNA: Reguladores de Mudanças Epigenéticas miRNA Família miR-29 alveja Regula enzimas envolvidas na metilação DNA de genes supressores DNMT3A, DNMT3B e DNMT1 causando desmetilação Linhagem de câncer de pulmão: introdução de miR-29 causou desmetilação do promotor de genes supressores  perda de tumorigenicidade Células AML: introdução de miR-29 causou perda de expressão do oncogene MCL1 e reativação de p16

28. Expressão de microRNA em Câncer Example: Profile MicroRNAs from Cancer and Normal Tissues.A susbset of the MicroRNA primers were used in this study to confirm published findings of 9 different MicroRNAs in 5 separate tumor vs. Normal RNA samples.

29. Terapia baseada em miRNA ou anti-miRNA miRNA podem estar deletados ou hiper expressos no câncer miRNA ou anti-miRNA (antagomir) podem ser consideradas drogas p/induzir apoptose e /ou parada do ciclo celular em células cancerosas com desregulação de miRNA Introdução de miRNA nos tumores: -diretamente nos tumores (fígado, medula, baço e rim) - ou utilização de vetores

30. RNA interferência – Terapia por miRNA -introduzidos em vetores: adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), retrovírus, lipossomos, injeção do RNA, nanopartículas Camundongos: -miR-15a e miR-16-1: tratamento da leucêmia -miR-26a: inibição da proliferação celular e indução de apoptose em hepatocarcinoma -família miR-29: suprimir câncer de pulmão e leucêmia (LMA) Triagem clínica: alvos -IL-10: tratamento da preeclâmpsia -VEGF e VEGFR-1: degeneração macular -BCR-ABL: LMC Riscos: miRNA/siRNA introduzidos exogenamente podem sequestrar componentes da maquinaria celular envolvidos no silenciamento gênico  reduzindo acessibilidade da maquinaria p/os miRNA endógenos

31. Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia devido o tamanho e carga negativa, não atravessam facilmente a membrana celular Vetores não virais: -conjugados de colesterol -nanopartículas de polications ligadas a transferrina -Anticorpos carregados positivamente -SNALP: bicamada lipídica conjugada com polietileno glicol difusível -MEA: partículas policonjugadas dinâmicas Vetores virais: -lentivírus: contra Ras (camundongo); doenças neurodegenerativas -Adenovírus: sistema nervoso central  injeção direta contra transcrito de ataxia espinocerebelar (camundongo) Riscos: imunogenicidade viral; mutações insercional

32. Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia -grupos de colesterol aumenta estabilidade do siRNA. Ex: entrega intravaginal (camundongo) siRNA contra HSV-2 Nanopartículas de polication podem introduzir os siRNA em células específicas através de ligantes de superfície (transferrina)  ao receptor das células alvos. Ex.: sarcoma Ewing (Ews-Fli1, mice); contra CCND1 em leucócitos camundongo Anticorpos especificos com protaminas (carga +)  entrega dos siRNA p/células específicas via receptor. Ex.: contra gene gag HIV

33. Estratégias de introdução dos siRNA in vivo para terapia Permite siRNA ser absorvido pelas células e liberado por endossomos. Ex.: siRNA contra APOB  fígado (primatas) Similar aos SNALPS, mas menores, contêm um ligante que permite entrega para as células alvos

34. Triagens clínicas para tratamento de doenças -Bevasiranib: contra VEGF  degeneração macular (crescimento de vasos atrás da retina)  perda visual. Tratamento  melhora da visão sem efeito colateral Também em fase II para tratamento de edema macular diabética -Alnylan Pharmaceuticals: contra genes implicados na hipercolesterolemia, doença de Huntington, hepatite C -Anti-tat/rev shRNA: triagem fase I para tratamento de linfoma da AIDS (vetor lentiviral em linhagens de células sanguíneas  infusão nos pacientes) -Doenças alvo p/tratamento: AIDS, Parkinson, degeneração macular, diabetes tipo 2, obesidade, hipercolesterolemia, artrite reumatóide, doenças respiratórias e câncer

35. TERAPIA – ANTAGONISTAS DE miRNA (AMOs) • -inibir miRNA oncogênicos utilizando antagonistas de miRNA: • anti-miRs, locked-nucleic acids (LNA) ou antagomiRs: são oligos com sequencias complementares aos miRNAs endógenos • Alteram a configuração do miRNA impedindo o processamento por RISC, ou degradam miRNA endógenos • Substituição do miRNA: reintrodução de um “miRNA mimic” supressor tumoral para restaurar uma perda de função Cancer Res. Author manuscript; available in PMC 2011 September 15.

36. Segurança da Terapia • Um único miRNA pode regular os níveis de centenas de proteínas  consequências de hipoexpressão ou expressão ectópica • relatos de mortes em camundongos  devido em parte a saturação do fator de transporte” exportina 5”, que transporta o miRNA do núcleo p/ citoplasma • -utilização de menor concentração possível de siRNA que forneça eficácia terapêutica • -siRNA alteram a expressão de genes alvos e não alvos • -estimulação da resposta imune celular