Urinary exosomes : is there a future?

1. Urinaryexosomes: is there a future? PatriciaGonzales, TrairakPisitkunand Mark A. KnepperLaboratory of Kidney & Electrolyte Metabolism National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health Bethesda, MD, USA Nephrol Dial Transplant (2008) 23: 1799–1801 Gdayllon Cavalcante Meneses

2. INTRODUÇÃO • Os exossomas são minúsculas vesículas (<100 nm) que contém diversas proteínas de membrana e citoplasmáticas das células de origem. • Foram primeiramente descritos em células sanguíneas, e estão presentes na maioria das células do corpo humano;

3. INTRODUÇÃO • São produzidos em todos os tipos de células epiteliais renais; • Os exossomas são vesículas originadas de corpos multivesiculares (MVB) no interior das células.

4. INTRODUÇÃO • Os Exossomos urinários constituem cerca de 3% do total de proteínas urinárias; • Quando exossomos são isolados, suas proteínas constituintes são enriquecidos > 30 vezes, melhorando a detecção de proteínas rara que pode ter valor de diagnóstico.

5. INTRODUÇÃO • A descoberta dos exossomas urinários; • Pode fornecer uma fonte de Biomarcadores protéicos para doenças • Fornecem importante significado fisiológico e patológico referente ao estado das células renais de origem.

6. INTRODUÇÃO

7. Formação dos exossomas urinários

8. MVBs

9. MICROGRAFIA ELETRÔNICA MVB

10. MICROGRAFIA ELETRÔNICA Exossomas urinários (40-100 nm)

11. Exossoma urinário

12. Objetivo • Discutir possíveis aplicações da análise de exossomas urinários, bem como as barreiras para seu desenvolvimento na prática clínica entre outros.

13. Como a análise de exossomas urinários poderia ser usado em pesquisa clínica? • A descoberta de biomarcadores com aplicação em larga escala:

14. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) • Importante ferramenta analítica para a análise de pequenas moléculas em diversas matrizes biológicas; • Diversos estudos têm sido direcionados no sentido de desenvolver metodologias, utilizando LC-MS/MS; • Exemplos: determinação de fármacos e metabolitos em biofluidos, análise de proteínas e peptídeos, determinação quantitativa de pequenas moléculas.

15. Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS)

16. Quais são os processos clínicos que poderiam se beneficiar com a análise de exossomas urinários e biomarcadores substitutos? • Potenciais aplicações: • Herança autossômica, doença renal policística dominante (DRPAD) (Hogan, etal 2007). • No transplante renal, onde os biomarcadores poderá fornecer orientações no intervalo antes da leitura da biópsia, permitindo uma escolha mais rápida da melhor terapia, na questão da lesão renal aguda x rejeição; • Grande potencial para as análises de mutações genéticas ( apresentam mRNA no seu lúmen).

17. Barreiras e limitações da Análise de exossomas urinários • Difícil quantificação, deve-se saber a taxa absoluta da excreção de cada proteína e comparar as taxas de excreção entre pacientes e controles; • Variação na excreção de água altera a concentração das proteínas; • Como alternativa pode-se utilizar marcadores exossomais (Alix ou TSG101) que são encontrados em todos os exossomos.

19. Uso do Inibidor de Protease • Preservar as proteínas associadas aos exossomas, durante estocagem transporte e etc; • É recomendável a estocagem das amostras a -80ºC; • Após descongelamento, as amostras devem ser centrifugadas extensivamente afim de aumentar a recuperar os exossomas da urina congelada.

20. Barreiras e limitações da Análise de exossomas urinários • Isolamento por Ultracentrifugação: • O mais efetivo! • Desvantagem: • Alto custo do equipamento; • Suporte inviável em ambientes clínicos. • Tendem a reter e concentrar proteínas solúveis que podem competir com as proteínas exossomais, dificultando a identificação.

21. PROCESSO DEULTRACENTRIFUGAÇÃO

22. Barreiras e limitações da Análise de exossomas urinários • Abordagens utilizando ultrafiltração: • São promissores, mas tendem a reter e concentrar proteínas solúveis na urina, além de exossomos. • Dificuldades nos processos de separação de interferentes.

23. Barreiras e limitações da Análise de exossomas urinários • A excreção da proteína Tamm-Horsfall(uromodulina, a mais abundante proteína excretada na urina). • Esta proteína tende a formar agregados fibrilares na urina, principalmente em baixa temperatura; • Estes agregados podem arrastar os exossomas e evitar o seu isolamento eficiente e purificação através de processos de centrifugação.

24. A análise de exossomas urinários é potencialmente útil para estudos fisiológicos? • Foi demonstrado que o isolamento de exossomas urinários detectou proteínas transportadoras de Na+ expressas ao longo dos túbulos renais (McKeeet al., 2000). • A Taxa de excreção de uma determinadaproteína é a diferença entre a taxa de sua produção e a taxa de sua degradação na célula; • Deve-se conhecer a taxa de degradação para poder estimar a taxa de produção dessas proteínas.

25. CONCLUSÃO Como qualquer nova ferramenta, a análise de exossomas tem vantagens e desvantagens que devem ser exploradas antes de qualquer análise. No entanto, dada a natureza não-invasiva do procedimento de coleta da amostra e a grande quantidade de informações potencialmente disponíveis a partir de tais estudos, parece provável que a análise de exosomas irá desempenhar um papel importante na pesquisa em nefrologia no futuro.

26. BOA TARDE!!